| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-19页 |
| 英文缩略表 | 第19-21页 |
| 第一章 引言 | 第21-35页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒概述 | 第21页 |
| ·PRRSV 的基因组结构与复制机制 | 第21-22页 |
| ·PRRSV 的基因组结构 | 第21-22页 |
| ·PRRSV 的复制机制 | 第22页 |
| ·PRRSV 编码蛋白 | 第22-24页 |
| ·PRRSV 的非结构蛋白 | 第22-23页 |
| ·PRRSV 的结构蛋白 | 第23-24页 |
| ·PRRSV 感染与先天性免疫 | 第24-29页 |
| ·Toll 样受体信号 | 第24-25页 |
| ·RIG-I 样受体信号 | 第25-26页 |
| ·JAK-STAT 信号通路 | 第26-27页 |
| ·PRRSV 感染对天性免疫的调控 | 第27-29页 |
| ·PI3K/Akt 信号通路 | 第29-32页 |
| ·PI3K 结构及其生物学功能 | 第29-30页 |
| ·Akt 通路及其生物学功能 | 第30-32页 |
| ·PI3K/Akt 通路与 PRRSV 感染 | 第32页 |
| ·天然免疫限制性因子 SAMHD1 与病毒感染 | 第32-34页 |
| ·SAMHD1 的结构与功能 | 第32-33页 |
| ·SAMHD1 与病毒感染 | 第33-34页 |
| ·本研究目的和意义 | 第34-35页 |
| 第二章 PRRSV 感染调控 PI3K/Akt 信号通路的研究 | 第35-49页 |
| ·材料和方法 | 第36-39页 |
| ·病毒和细胞 | 第36页 |
| ·抗体和试剂 | 第36页 |
| ·病毒灭活 | 第36页 |
| ·病毒感染和抑制剂处理 | 第36-37页 |
| ·抑制剂细胞毒性实验 | 第37页 |
| ·HuN4-F112 株 GSK-3 抑制剂突变株的筛选 | 第37页 |
| ·细胞裂解和 Western blot 分析 | 第37-38页 |
| ·总 RNA 的提取与 cDNA 的合成 | 第38-39页 |
| ·结果 | 第39-47页 |
| ·HuN4 感染活化 Akt 信号通路 | 第39页 |
| ·LY294002 和 GSK-3 inhibitor X 对细胞活性的影响 | 第39-40页 |
| ·HuN4 感染 MARC-145 细胞导致 Akt 磷酸化上调受 PI3K 调控 | 第40-41页 |
| ·灭活病毒诱导 PAM 细胞 Akt 早期磷酸化 | 第41-42页 |
| ·HP-PRRSV 感染调控 Akt 下游分子 FoxO1、Bad 促进自身增殖 | 第42页 |
| ·抑制 Akt 的磷酸化影响细胞病变（CPE）的形成 | 第42-44页 |
| ·Akt 下游分子 GSK-3 的活性与 HuN4 的增殖相关 | 第44-46页 |
| ·HuN4-F112 株 GSK-3 抑制剂突变株的筛选 | 第46-47页 |
| ·讨论 | 第47-49页 |
| 第三章 猪 SAMHD1 基因序列扩增及单克隆抗体的制备 | 第49-59页 |
| ·材料与方法 | 第50-52页 |
| ·细胞与样品 | 第50页 |
| ·质粒、抗体和试剂 | 第50页 |
| ·总 RNA 的提取与 cDNA 的合成 | 第50页 |
| ·猪 SAMHD1 全基因序列扩增 | 第50-51页 |
| ·猪 SAMHD1 蛋白原核表达与纯化 | 第51-52页 |
| ·猪 SAMHD1 蛋白单克隆抗体的制备 | 第52-53页 |
| ·小鼠免疫 | 第52页 |
| ·单克隆抗体的制备 | 第52-53页 |
| ·单克隆抗体效价与特异性鉴定 | 第53页 |
| ·结果 | 第53-57页 |
| ·SAMHD1 全基因序列扩增 | 第53-54页 |
| ·猪 SAMHD1 原核表达载体的构建 | 第54-56页 |
| ·重组猪 SAMHD1 表达、纯化与鉴定 | 第56-57页 |
| ·猪 SAMHD1 单克隆抗体的制备、效价测定与特异性鉴定 | 第57页 |
| ·IFA 检测内源性猪 SAMHD1 表达 | 第57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| 第四章 猪 SAMHD1 组织细胞定位及抗病毒作用的研究 | 第59-72页 |
| ·材料与方法 | 第60-63页 |
| ·细胞与病毒 | 第60页 |
| ·质粒、抗体及试剂 | 第60页 |
| ·总 RNA 提取与 cDNA 的合成 | 第60页 |
| ·猪 SAMHD1 基因序列分析 | 第60页 |
| ·真核表达载体的构建与质粒转染 | 第60-61页 |
| ·SAMHD1 亚细胞定位与组织分布 | 第61页 |
| ·过表达 SAMHD1 对 HP-PRRSV 的影响 | 第61页 |
| ·IFA 检测 HP-PRRSV 的增殖 | 第61-62页 |
| ·Strand-specific quantitative RT-PCR (qRT-PCR)检测 HP-PRRSV 增殖 | 第62页 |
| ·干扰素刺激因子 ISG15 和 ISG56 表达量检测 | 第62页 |
| ·Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 电泳及 western blot 分析 | 第62-63页 |
| ·结果 | 第63-70页 |
| ·猪 SAMHD1 基因序列分析 | 第63页 |
| ·猪 SAMHD1 亚细胞定位与组织分布 | 第63-64页 |
| ·过表达 SAMHD1 显著抑制 HuN4 在 MARC-145 细胞中的增殖 | 第64-68页 |
| ·过表达 SAMHD1 蛋白主要以非磷酸化形式存在 | 第68页 |
| ·过表达 SAMHD1 抑制 HuN4 病毒 cRNA 链的合成 | 第68页 |
| ·过表达 SAMHD1 显著上调 ISG15 和 ISG56 的转录 | 第68-70页 |
| ·讨论 | 第70-72页 |
| 第五章 SAMHD1 表达调控机制研究 | 第72-83页 |
| ·材料和方法 | 第73-75页 |
| ·病毒和细胞 | 第73页 |
| ·质粒、抗体和试剂 | 第73页 |
| ·真核表达质粒的构建 | 第73页 |
| ·Real-time PCR 定量分析 SAMHD1 基因 mRNA 表达量 | 第73-74页 |
| ·细胞处理与转染 | 第74页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第74-75页 |
| ·RNA 干扰与回补实验 | 第75页 |
| ·结果 | 第75-80页 |
| ·IFN-α能显著诱导 MARC-145 细胞和 PAM 细胞中 SAMHD1 的上调表达 | 第75-76页 |
| ·TLR3 和 RIG-I 通路参与 SAMHD1 上调表达 | 第76-77页 |
| ·TBK1 参与 SAMHD1 的诱导表达 | 第77页 |
| ·活化的 IRFs 诱导 SAMHD1 的表达 | 第77-78页 |
| ·NDV 感染通过磷酸化 IRF-3 上调表达 SAMHD1 | 第78-79页 |
| ·抑制 IRF-3 的磷酸化入核无法诱导 SAMHD1 上调表达 | 第79-80页 |
| ·讨论 | 第80-83页 |
| 第六章 PRRSV 感染调控 SAMHD1 机制的研究 | 第83-99页 |
| ·材料与方法 | 第84-85页 |
| ·细胞与病毒 | 第84页 |
| ·质粒、抗体和试剂 | 第84页 |
| ·细胞样品收取与 real-time RT-PCR 分析 SAMHD1 mRNA 表达 | 第84页 |
| ·Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 电泳及 western blot | 第84页 |
| ·免疫沉淀实验 | 第84页 |
| ·RNA 干扰实验 | 第84页 |
| ·抑制剂处理细胞和病毒感染 | 第84-85页 |
| ·结果 | 第85-96页 |
| ·PRRSV 感染 MARC-145 细胞和 PAM 细胞 SAMHD1 表达具有一定的差异 | 第85-86页 |
| ·HuN4 感染 MARC-145 细胞抑制 IRF-3 的磷酸化 | 第86-87页 |
| ·HuN4 病毒感染通过阻止 IRF-3 入核来抑制 SAMHD1 的上调表达 | 第87-88页 |
| ·HuN4 感染 MARC-145 细胞直接抑制 IRF-3 的磷酸化 | 第88页 |
| ·HuN4 感染 PAM 细胞上调 IRF-3 的磷酸化 | 第88-89页 |
| ·HuN4 感染 PAM 细胞通过 RIG-I/MDA5/TBK1 通路激活 IRF-3 | 第89页 |
| ·PAM 细胞中抑制 IRF-3 的磷酸化入核阻止 SAMHD1 的上调表达 | 第89-90页 |
| ·抑制 PAM 细胞中 SAMHD1 上调表达促进 HuN4 病毒的增殖 | 第90-91页 |
| ·MARC-145 细胞 SAMHD1 处于磷酸化状态 | 第91-92页 |
| ·PK-15 细胞中 SAMHD1 处于磷酸化状态 | 第92页 |
| ·MARC-145 细胞中 SAMHD1 与 CyclinA2/CDK1 互作 | 第92页 |
| ·PRRSV 感染 MARC-145 细胞促进 CDK1 的活性 | 第92-93页 |
| ·抑制 CyclinA2/CDK1 复合体的功能能够阻止 HuN4 病毒的增殖 | 第93-94页 |
| ·干扰 MARC-145 细胞中 SAMHD1 的表达对 HuN4 增殖没有显著影响 | 第94-95页 |
| ·PRRSV 感染 PAM 细胞 SAMHD1 处于非磷酸化状态 | 第95-96页 |
| ·IFN-α诱导 SAMHD1 表达以非磷酸化形式存在 | 第96页 |
| ·讨论 | 第96-99页 |
| 第七章 全文结论 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-115页 |
| 附录 | 第115-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 作者简历 | 第118页 |
