| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 符号与缩略语说明 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-30页 |
| 1 硝基苯酚类化合物的生物降解及代谢过程中双加氧酶的研究 | 第14-21页 |
| ·硝基苯酚类化合物的生物降解现状 | 第14-16页 |
| ·对硝基苯酚微生物降解基因研究现状 | 第16-17页 |
| ·开环双加氧酶的结构和功能的研究 | 第17-21页 |
| 2 酶的底物抑制的研究 | 第21-25页 |
| 参考文献 | 第25-30页 |
| 第一章 1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶(PnpC)截短表达研究 | 第30-58页 |
| 1 材料与方法 | 第31-41页 |
| ·菌株和质粒 | 第31页 |
| ·培养条件及抗生素 | 第31页 |
| ·试剂及相关仪器设备 | 第31-32页 |
| ·1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶(PnpC)N-端截短表达目的片段的克隆 | 第32-35页 |
| ·PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第33页 |
| ·酶连 | 第33-34页 |
| ·普通感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第34页 |
| ·酶连产物的转化 | 第34页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第34-35页 |
| ·测序验证 | 第35页 |
| ·PnpC蛋白质N-端截短表达载体的构建 | 第35-38页 |
| ·基因片段的NdeI/XhoI双酶切及纯化 | 第36-37页 |
| ·pET-29(+)的NdeI/XhoI双酶切及纯化 | 第37页 |
| ·目的基因与pET-29a(+)载体的酶连 | 第37-38页 |
| ·酶连产物的转化和表达菌株的构建 | 第38页 |
| ·表达菌株的测序验证 | 第38页 |
| ·PnpC蛋白截短实验表达产物的表达、纯化 | 第38页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第38-39页 |
| ·样品的处理 | 第38-39页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶的灌制 | 第39页 |
| ·PnpC蛋白截短实验表达产物表达产物的酶活体系的建立 | 第39页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第39-40页 |
| ·结晶前的准备工作 | 第40页 |
| ·盖玻片的硅烷化 | 第40页 |
| ·晶体生长板的处理 | 第40页 |
| ·结晶池液的准备 | 第40页 |
| ·截短蛋白质的结晶条件初筛 | 第40-41页 |
| ·PnpC_(46)/PnpC_(23)蛋白质的结晶条件初筛 | 第40-41页 |
| ·蛋白质晶体的初步检查 | 第41页 |
| ·防冻液的选择及蛋白质晶体的挑取 | 第41页 |
| 2 结果与分析 | 第41-54页 |
| ·1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶(PnpC)N-端截短目的片段的PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·表达载体pET29a-pnpC_(23)/pET29a-pnpC_(10)/pET29a-pnpC_5的构建 | 第42-43页 |
| ·PnpC酶N-端截短表达载体的重组表达 | 第43-44页 |
| ·PnpC_(23)/PnpC_(10)/PnpC_5的酶活力测定 | 第44-45页 |
| ·PnpC_(23)/PnpC_(46)蛋白质的纯化 | 第45-47页 |
| ·PnpC_(23)蛋白质的纯化 | 第45-46页 |
| ·PnpC_(46)蛋白质的纯化 | 第46-47页 |
| ·PnpC_(23)/PnpC_(46)蛋白质晶体生长、结晶条件及初步检查 | 第47-54页 |
| ·PnpC_(23)/PnpC_(46)蛋白质晶体生长 | 第47-48页 |
| ·PnpC_(23)/PnpC_(46)蛋白质的结晶条件 | 第48-54页 |
| ·PnpC_(23)/PnpC_(46)蛋白质晶体的初步检查 | 第54页 |
| 3 本章小结 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-58页 |
| 第二章 对硝基苯酚-4-单加氧酶(PnpA)底物抑制现象的研究 | 第58-70页 |
| 1 材料与方法 | 第58-61页 |
| ·菌株 | 第58页 |
| ·培养条件及抗生素 | 第58-59页 |
| ·试剂及相关仪器设备 | 第59页 |
| ·PnpA蛋白质的表达、纯化 | 第59页 |
| ·亚硝酸根测定标准曲线的制作 | 第59-60页 |
| ·PnpA蛋白质底物抑制的研究 | 第60-61页 |
| ·PnpA降解PNP的时间进程曲线 | 第60页 |
| ·PnpA与FAD结合时间对PnpA酶活力的影响 | 第60页 |
| ·PnpA降解PNP的最适反应酶反应体系 | 第60-61页 |
| ·PNP浓度对PnpA酶活力的影响 | 第61页 |
| ·FAD浓度对PnpA酶活力的影响 | 第61页 |
| ·NADH浓度对PnpA酶活力的影响 | 第61页 |
| 2 结果与分析 | 第61-67页 |
| ·PnpA蛋白质的纯化 | 第61-62页 |
| ·PnpA底物抑制现象的研究 | 第62-67页 |
| ·PnpA降解PNP的时间进程曲线 | 第62-63页 |
| ·最适PnpA与FAD结合时间 | 第63-64页 |
| ·PNP降解的最适酶反应体系 | 第64页 |
| ·PNP浓度对PnpA酶活力的影响 | 第64-65页 |
| ·FAD浓度对PnpA酶活力的影响 | 第65-66页 |
| ·NADH浓度对PnpA酶活力的影响 | 第66-67页 |
| 3 本章小结 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-70页 |
| 第三章 Pseudomonas putida DLL-E4基因簇pnp_2中pnpC_1C_2b/pnpAb基因的研究 | 第70-86页 |
| 1 材料与方法 | 第70-78页 |
| ·菌株和质粒 | 第70页 |
| ·培养基与试剂 | 第70页 |
| ·抗生素及使用浓度 | 第70-71页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第71页 |
| ·pnpC_1C_2b及pnpAb的PCR扩增、纯化及TA克隆 | 第71-75页 |
| ·pnpC_1C_2b及pnpAb的PCR扩增 | 第71-74页 |
| ·pnpC_1C_2b的PCR扩增 | 第71-72页 |
| ·pnpAb的PCR扩增 | 第72-74页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第74页 |
| ·PCR产物加A尾 | 第74页 |
| ·酶连 | 第74-75页 |
| ·普通感受态细胞的制备 | 第75页 |
| ·酶连产物的转化 | 第75页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第75页 |
| ·测序验证 | 第75页 |
| ·表达载体pET29a-pnpC_1C_2b及pET29a-pnpAb的构建 | 第75-77页 |
| ·基因片段的NdeI/XhoI双酶切及纯化 | 第75-76页 |
| ·pET-29a(+)的NdeI/XhoI双酶切及纯化 | 第76页 |
| ·目的基因与pET-29a(+)载体的酶连 | 第76页 |
| ·酶连产物的转化和表达菌株的构建 | 第76页 |
| ·表达菌株的测序验证 | 第76-77页 |
| ·PnpC_1C_2b及PnpAb蛋白质的表达 | 第77页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第77页 |
| ·PnpC_1C_2b及PnpAb蛋白质的酶活力测定 | 第77-78页 |
| ·PnpC_1C_2b的酶活力测定 | 第77页 |
| ·PnpAb的酶活力测定 | 第77-78页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第78页 |
| 2 结果与分析 | 第78-83页 |
| ·pnpC_1C_2b及pnpAb的扩增和TA克隆 | 第78-80页 |
| ·pnpC_1C_2b的扩增和TA克隆 | 第78-79页 |
| ·pnpAb的扩增和TA克隆 | 第79-80页 |
| ·表达载体pET29a-pnpC_1C_2b及pET29a-pnpAb的构建 | 第80页 |
| ·PnpC_1C_2b/PnpAb蛋白质的重组表达 | 第80-81页 |
| ·PnpC_1C_2b/PnpAb蛋白质的酶活力测定 | 第81-83页 |
| ·PnpC_1C_2b的酶活力测定 | 第81-82页 |
| ·PnpAb的酶活力测定 | 第82-83页 |
| 3 本章小结 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-86页 |
| 全文总结 | 第86-88页 |
| 本文创新之处 | 第88-90页 |
| 附录一 文中所用的试剂、培养基及相关缓冲体系配方 | 第90-92页 |
| 附录二 文中所用蛋白质的氨基酸序列 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
