| 简略表 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 前言 | 第12-21页 |
| 1.多形汉逊酵母表达系统的研究进展 | 第12-16页 |
| ·汉逊酵母启动子 | 第12-14页 |
| ·rDNA—多拷贝高效定点整合的表达载体元件 | 第14-15页 |
| ·GFP报告基因在汉逊酵母中的应用 | 第15-16页 |
| ·LUC报告基因在汉逊酵母中的应用 | 第16页 |
| 2.牛促卵泡激素α亚基和β亚基的研究进展 | 第16-21页 |
| ·促卵泡激素的基因结构 | 第17页 |
| ·重组促卵泡激素的研究进展 | 第17-21页 |
| 第一部分 多形汉逊酵母表达平台的改进 | 第21-35页 |
| 摘要 | 第21页 |
| 关键词 | 第21页 |
| Abstract | 第21-22页 |
| Key words | 第22页 |
| 前言(introduction) | 第22页 |
| 1.材料和方法 | 第22-27页 |
| ·菌株和载体 | 第22页 |
| ·培养基和生化试剂 | 第22-23页 |
| ·所涉及的引物 | 第23-24页 |
| ·表达载体的改进 | 第24-26页 |
| ·带25SrDNA,18SrDNA定点整合元件的载体构建 | 第24-25页 |
| ·zeocein抗性→G418抗性载体的改造 | 第25页 |
| ·表达载体多可隆位点的获得 | 第25页 |
| ·G418分泌型表达载体的构建 | 第25页 |
| ·报告基因GFP和Luc的克隆与标记 | 第25-26页 |
| ·热击转化大肠杆菌DH5α | 第26页 |
| ·电转化汉逊酵母 | 第26页 |
| ·PCR鉴定各种重组转化子 | 第26-27页 |
| ·PCR鉴定大肠杆菌转化子 | 第26页 |
| ·PCR鉴定汉逊酵母重组转化子 | 第26-27页 |
| ·酵母培养和诱导培养 | 第27页 |
| ·报告基因的检测 | 第27页 |
| ·GFP表达情况检测 | 第27页 |
| ·Luc表达情况的检测 | 第27页 |
| ·Southern blot分析拷贝数 | 第27页 |
| 2.结果与分析 | 第27-33页 |
| ·载体构建的PCR鉴定结果 | 第27-30页 |
| ·25SrDNA的克隆鉴定 | 第27-28页 |
| ·pHFMD-G-alpha-AT-25S酶切鉴定结果 | 第28-29页 |
| ·pHFMD-G-alpha-AT-25S-GFP酶切鉴定结果 | 第29页 |
| ·pHFMD-G-alpha-AT-25S-Luc酵母重组子的鉴定 | 第29-30页 |
| ·来自酵母本身的整和元件的载体的转化率和拷贝数鉴定 | 第30-31页 |
| ·报告基因在多型汉逊酵母中的诱导表达结果 | 第31-33页 |
| ·GFP的表达结果 | 第31页 |
| ·Luc的表达结果 | 第31-33页 |
| 3.讨论 | 第33-35页 |
| 第二部分 牛促卵泡激素α亚基在多形汉逊酵母中的表达 | 第35-53页 |
| 摘要 | 第35页 |
| 关键词 | 第35页 |
| Abstract | 第35-36页 |
| Keywords | 第36页 |
| 前言(Introduction) | 第36页 |
| 1.材料与方法 | 第36-43页 |
| ·菌株 | 第36-37页 |
| ·试剂和所用仪器 | 第37页 |
| ·FSHα cDNA基因合成 | 第37-40页 |
| ·表达载体的构键 | 第40-41页 |
| ·各种重组转化子的PCR鉴定 | 第41页 |
| ·PCR鉴定大肠杆菌转化子 | 第41页 |
| ·PCR鉴定汉逊酵母重组转化子 | 第41页 |
| ·pHFMD-Z-alpha-A-FSHα与pHFMD-Z-α-A-25SFSHα表达量的比较 | 第41-42页 |
| ·发酵条件优化 | 第42页 |
| ·间接ELISA检测表达情况 | 第42页 |
| ·重组酵母菌表达产物的纯化 | 第42页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE及Western blot鉴定 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第42-43页 |
| ·Western blot鉴定 | 第43页 |
| 2.结果与分析 | 第43-52页 |
| ·基因优化与合成 | 第43-44页 |
| ·PCR鉴定pHFMD-Z-alpha-A-FSHα和pHFMD-Z-α-A-25SFSHα大肠重组子结果 | 第44-45页 |
| ·汉逊酵母重组子的PCR鉴定结果 | 第45-46页 |
| ·ELISA检测pHFMD-Z-alpha-A-FSHα酵母重组子表达结果 | 第46-47页 |
| ·优化基因的表达结果 | 第47页 |
| ·pHFMDZ-α-A-FSHα与pHFMD-Z-α-A-25SFSHα重组酵母表达量的比较 | 第47-48页 |
| ·pHFMDZ-α-A-FSHα表达产物SDS-PAGE电泳结果 | 第48页 |
| ·Western blot鉴定结果 | 第48-50页 |
| ·发酵条件优化的表达情况 | 第50-52页 |
| 3.讨论 | 第52-53页 |
| 第三部分 牛促卵泡激素β亚基在多形汉逊酵母中的表达 | 第53-62页 |
| 摘要 | 第53页 |
| 关键词 | 第53页 |
| Abstract | 第53页 |
| Keywords | 第53页 |
| 前言(Introduction) | 第53-54页 |
| 1.材料与方法 | 第54-58页 |
| ·菌株 | 第54页 |
| ·试剂和所用仪器 | 第54页 |
| ·FSHβ cDNA基因合成 | 第54-56页 |
| ·表达载体的构建 | 第56-57页 |
| ·各种重组转化子的PCR鉴定 | 第57页 |
| ·PCR鉴定大肠杆菌转化子 | 第57页 |
| ·PCR鉴定汉逊酵母重组转化子 | 第57页 |
| ·ELISA检测pHFMD-Z-alpha-A-FSHβ表达情况 | 第57页 |
| ·Western blot鉴定 | 第57-58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-61页 |
| ·FSHβ cDNA的合成 | 第58-59页 |
| ·PCR鉴定大肠杆菌转化子结果 | 第59页 |
| ·PCR鉴定汉逊酵母重组pHFMD-Z-alpha-A-FSHβ的结果 | 第59-60页 |
| ·ELISA检测pHFMD-Z-alpha-A-FSHβ表达结果 | 第60-61页 |
| ·Western blot分析结果 | 第61页 |
| 3.讨论 | 第61-62页 |
| 总结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 附录 | 第71-90页 |
| 1.汉逊酵母感受态细胞的制备和电转化 | 第71-72页 |
| 2.TSS一步法转化大肠杆菌 | 第72页 |
| 3.玻璃奶回收DNA(Roche) | 第72-73页 |
| 4.质粒的快速提取(碱裂解法) | 第73-74页 |
| 5.DNA片段的5’加磷处理 | 第74页 |
| 6.DNA片段的5’脱磷处理 | 第74页 |
| 7.酶切和连接反应 | 第74-75页 |
| 8.电转用大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第75-76页 |
| 9.消平 | 第76页 |
| 10.补平 | 第76-77页 |
| 11.琼脂糖电泳缓冲液(20×TAE：1L) | 第77页 |
| 12.质粒的EB纯化 | 第77页 |
| 13.单菌落电泳鉴定重组质粒 | 第77-78页 |
| 14.玻璃珠法提取酵母基因组 | 第78-79页 |
| 15.低盐LB(用于Zeocin抗性大肠杆菌的筛选) | 第79页 |
| 16.PCR级别引物：50pmol／μl浓度的配制 | 第79页 |
| 17.ELISA封闭液Casein的配制 | 第79-80页 |
| 18.蓝白斑筛选用的Amp／X-gal／IPTG平板： | 第80页 |
| 19.引物设计：5’保护碱基对限制性内切酶的切割效率 | 第80-81页 |
| 20.细胞干重(Cell dry weight,CDW)的计算 | 第81页 |
| 21 Ni~(2+)亲和层析纯化蛋白 | 第81页 |
| 22.SDS-PAGE蛋白电泳 | 第81-83页 |
| 23.蛋白银染 | 第83页 |
| 24.蛋白质的浓缩(TCA法) | 第83-84页 |
| 25.半干转印(Amersham,Hoefer TE 70) | 第84-85页 |
| 26.ECL-western blotting | 第85页 |
| 27.Southern Bloting | 第85-88页 |
| 28.常用的TE缓冲液 | 第88页 |
| 29.ELISA试剂 | 第88-90页 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
