| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-15页 |
| 一.前言 | 第15-24页 |
| 1.人类基因组计划及其解读 | 第15-16页 |
| 2.筛选基因表达调控元件的主要方法 | 第16-18页 |
| 3.本实验室以前的工作及其改进 | 第18-20页 |
| 4.载脂蛋白(a)的结构、生理意义及其表达调控研究的状况 | 第20-22页 |
| 5.本研究的主要内容 | 第22-24页 |
| 二.材料与方法 | 第24-51页 |
| (一) 实验材料 | 第24-30页 |
| 1.菌株与细胞系 | 第24页 |
| 2.质粒载体 | 第24-26页 |
| 3.限制性内切酶与修饰酶 | 第26页 |
| 4.培养基 | 第26页 |
| 5.寡核苷酸 | 第26页 |
| 6.试剂盒 | 第26-27页 |
| 7.放射性核素 | 第27页 |
| 8.其它主要试剂 | 第27页 |
| 9.主要仪器设备 | 第27-28页 |
| 10.核蛋白提取液的配制 | 第28-30页 |
| (二) 实验方法 | 第30-51页 |
| 1.实验基本技术路线图 | 第30-32页 |
| 2.人BAC-Apo(a)-Plasminogen基因簇物理图谱的构建 | 第32-36页 |
| ·人BAC-Apo(a)-Plasminogen基因簇阳性克隆DNA小量制备 | 第32页 |
| ·PFGE鉴定各克隆大小 | 第32-33页 |
| ·PCR初步定位 | 第33页 |
| ·BAC-Apo(a)-33的不同限制性内切酶消化分析 | 第33-34页 |
| ·Sfi Ⅰ部分酶切分析 | 第34-35页 |
| ·Southern杂交定位分析 | 第35-36页 |
| ·末端测序分析及Blast分析 | 第36页 |
| 3.人BAC-Apo(a)-Plasminogen基因簇BAC DNA制备、纯化与回收 | 第36-37页 |
| ·BAC DNA的大量制备及纯化 | 第36页 |
| ·BAC DNA的超离纯化 | 第36页 |
| ·BAC DNA的Not Ⅰ酶切与脉冲场凝胶电泳回收纯化 | 第36-37页 |
| 4.多轮PCR-EMSA循环富集Apo(a)-Plasminogen基因簇中的调控片段 | 第37-41页 |
| ·EMSA探针的制备 | 第37-40页 |
| ·超声打断大片段BAC DNA | 第37页 |
| ·小片段DNA的削平 | 第37页 |
| ·DNA片段的纯化 | 第37-38页 |
| ·Oligo E的磷酸化和DNA连接子的形成 | 第38页 |
| ·连接反应 | 第38页 |
| ·PCR扩增 | 第38-39页 |
| ·第一轮凝胶阻滞实验用的人BAC DNA探针的制备 | 第39页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收 | 第39-40页 |
| ·细胞核粗提物的制备 | 第40页 |
| ·细胞复苏与培养 | 第40页 |
| ·细胞冻存 | 第40页 |
| ·核粗提物的制备 | 第40页 |
| ·蛋白定量 | 第40页 |
| ·多轮聚丙烯酰胺凝胶阻滞法富集调节片段 | 第40-41页 |
| ·EMSA探针与HepG2细胞核粗提物第一轮凝胶阻滞实验 | 第40-41页 |
| ·DNA探针与HepG2细胞核粗提物的多轮凝胶阻滞实验 | 第41页 |
| 5.整体自身竞争EMSA | 第41-43页 |
| ·自身竞争冷探针的制备 | 第42页 |
| ·整体自身竞争EMSA | 第42-43页 |
| ·回收DNA中自身竞争探针的扣除 | 第43页 |
| 6.BAC-Apo(a)-Plasminogen基因簇亚克隆文库的构建 | 第43-45页 |
| ·插入片段的制备 | 第43页 |
| ·插入片段的酶切消化与部分补平 | 第43-44页 |
| ·质粒pGL3promoter的线性化与部分补平 | 第44页 |
| ·载体DNA的去磷酸化处理 | 第44-45页 |
| ·插入片段与载体DNA的连接 | 第45页 |
| ·DH5a感受态细胞的制备与转化 | 第45页 |
| ·文库的保存 | 第45页 |
| 7.亚克隆文库的筛选 | 第45-47页 |
| ·质粒文库的扩增 | 第45-46页 |
| ·铺制平板及菌落的转印 | 第46页 |
| ·菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素膜 | 第46页 |
| ·筛库探针的制备 | 第46页 |
| ·亚克隆文库的杂交与筛选 | 第46-47页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定与保存 | 第47页 |
| 8.所富集调节片段的初步分析 | 第47-48页 |
| ·序列分析 | 第47页 |
| ·BLAST同源性分析 | 第47页 |
| ·DNA上潜在反式作用因子结合位点的分析 | 第47-48页 |
| 9.调节片段的转克隆 | 第48-49页 |
| ·转换至pGL3p载体的不同位置 | 第48-49页 |
| ·转换至pGL3c载体 | 第49页 |
| 10.瞬时转染分析调节片段对荧光素酶报告基因表达的影响 | 第49-51页 |
| ·转染DNA的纯化、无菌处理和定量分析 | 第49-50页 |
| ·Lipofectamine 2000~(TM)介导的HepG2细胞转染 | 第50页 |
| ·转染细胞的收集和裂解 | 第50页 |
| ·荧光强度的检测 | 第50页 |
| ·β-半乳糖苷酶内对照活性的测定 | 第50-51页 |
| 三.实验结果 | 第51-79页 |
| (一) 人BAC-Apo(a)-Plasminogen基因簇物理图谱的构建 | 第51-55页 |
| 1.脉冲场凝胶电泳鉴定各BAC-Apo(a)-Plasminogen克隆的大小 | 第51页 |
| 2.PCR初步定位 | 第51-52页 |
| 3.BAC-Apo(a)-33的不同限制性内切酶消化分析和Sfi Ⅰ部分酶切 | 第52页 |
| 4.部分酶切后杂交分析的结果 | 第52-53页 |
| 5.末端测序分析及Blast同源性比较 | 第53页 |
| 6.BAC-Apo(a)-33在Apo(a)-Plasminogen基因簇中的定位 | 第53-55页 |
| (二) PCR-EMSA循环探针的制备与调节片段的富集 | 第55-57页 |
| 1.BAC-Apo(a)-33的大量制备与插入片段的回收 | 第55-56页 |
| 2.BAC DNA的超声打断 | 第56页 |
| 3.凝胶阻滞实验的探针回收 | 第56页 |
| 4.多轮凝胶阻滞实验富集调控片段 | 第56-57页 |
| (三) 整体自身竞争EMSA及阻滞带的回收 | 第57-58页 |
| (四) 用不同探针筛选BAC-Apo(a)-33亚克隆文库 | 第58-60页 |
| 1.亚克隆文库的构建 | 第58-59页 |
| 2.用不同探针对文库进行筛选 | 第59-60页 |
| (五) 阳性克隆的初步分析 | 第60-75页 |
| 1.酶切分析 | 第60页 |
| 2.DNA调节片段的序列分析 | 第60-63页 |
| 3.Blast同源性分析与定位 | 第63-67页 |
| 4.DNA上潜在反式因子结合位点分析 | 第67-75页 |
| (六) 荧光素酶报告基因重组质粒的瞬时表达分析 | 第75-79页 |
| 1.克隆于pGL3p BamHⅠ位点的调节片段转染检测结果 | 第75页 |
| 2.克隆于pGL3p SalⅠ、NheⅠ位点的调节片段转染检测结果 | 第75-78页 |
| 3.克隆于pGL3c SalⅠ、NheⅠ位点的调节片段转染检测结果 | 第78-79页 |
| 四.讨论 | 第79-87页 |
| (一) 人33号BAC-Apo(a)-Plasminogen克隆的定位分析及其研究价值 | 第79页 |
| (二) RERS方法的原理及其优缺点 | 第79-81页 |
| 1.RERS方法的作用原理 | 第79-80页 |
| 2.该方法的优点和有待改进之处 | 第80-81页 |
| (三) 改进后的方法及其优缺点 | 第81-82页 |
| (四) 所富集调节片段定位结果的分析及反式因子结合位点分析 | 第82-83页 |
| 1.同源性比较与定位结果的分析 | 第82-83页 |
| 2.潜在反式因子结合位点分析 | 第83页 |
| (五) 转染结果分析 | 第83-84页 |
| 1.基本转染结果的分析 | 第83-84页 |
| 2.转染分析的局限性和改进措施 | 第84页 |
| (六) 向高通量方向发展 | 第84-85页 |
| (七) 多种方法相结合解读调控密码 | 第85-87页 |
| 五.小结 | 第87-88页 |
| 六.参考文献 | 第88-94页 |
| 七.综述染色质重塑复合物 | 第94-100页 |
| 八.英文名词及缩写 | 第100-103页 |
| 九.致谢 | 第103-104页 |
| 十.个人简历 | 第104-105页 |
| 十一.附录(1-8页) | 第105-112页 |
