| 中文摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 前言 | 第13-16页 |
| 材料和方法 | 第16-28页 |
| 实验材料 | 第16-18页 |
| 1.质粒、菌株和细胞株 | 第16页 |
| 2.实验动物 | 第16页 |
| 3.分子生物学试剂 | 第16-17页 |
| ·限制性内切酶 | 第16页 |
| ·其它工具酶 | 第16页 |
| ·DNA分子量标准 | 第16页 |
| ·试剂盒 | 第16-17页 |
| ·分子杂交试剂 | 第17页 |
| 4.细胞培养用试剂 | 第17页 |
| 5.其它主要化学试剂和材料 | 第17页 |
| 6.探针 | 第17页 |
| 7.引物 | 第17-18页 |
| 8.主要仪器设备 | 第18页 |
| 实验方法 | 第18-28页 |
| 1.分子生物学方法 | 第18-23页 |
| ·感受态细菌的制备 | 第18页 |
| ·质粒DNA的转化 | 第18页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第18-19页 |
| ·DNA限制性内切酶酶切及其他工具酶的处理 | 第19页 |
| ·DNA限制性内切酶酶切 | 第19页 |
| ·用DNA聚合酶I klenow大片段酶补平粘末端 | 第19页 |
| ·用碱性磷酸酶(CIAP)脱磷酸化作用 | 第19页 |
| ·DNA片段的连接 | 第19页 |
| ·质粒DNA的大量制备与纯化 | 第19页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第19页 |
| ·PEG方法纯化质粒 | 第19页 |
| ·DNA片段的回收 | 第19-20页 |
| ·酶切制备 | 第19-20页 |
| ·低熔点琼脂糖凝胶电泳回收 | 第20页 |
| ·PEG8000回收法 | 第20页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)鉴定转基因鼠 | 第20页 |
| ·apoE转基因鼠的鉴定 | 第20页 |
| ·APP转基因鼠的鉴定 | 第20页 |
| ·RT-PCR扩增新基因 | 第20-21页 |
| ·核苷酸序列的测定和分析 | 第21页 |
| ·Southern杂交 | 第21页 |
| ·电泳分离基因组DNA的酶切片段 | 第21页 |
| ·Southern转膜 | 第21页 |
| ·随机引物法探针标记 | 第21页 |
| ·杂交 | 第21页 |
| ·洗膜与放射自显影 | 第21页 |
| ·小鼠组织总RNA、mRNA、cDNA的制备及Northern blot分析 | 第21-22页 |
| ·小鼠组织总RNA的制备： | 第21-22页 |
| ·从总RNA中提取mRNA | 第22页 |
| ·逆转录合成cDNA | 第22页 |
| ·逆转录总cDNA探针的合成 | 第22页 |
| ·RNA的甲醛变性胶电泳和Northern杂交 | 第22页 |
| ·cDNA表达点阵 | 第22-23页 |
| ·PCR法检测RNA样品中基因组DNA的污染 | 第22页 |
| ·逆转录合成cDNA探针及探针的纯化 | 第22-23页 |
| ·空白尼龙膜杂交检测cDNA探针的纯度 | 第23页 |
| ·转基因鼠和正常鼠肾脏cDNA探针分别与cDNA表达点阵的两张膜杂交 | 第23页 |
| ·cDNA表达点阵杂交结果分析 | 第23页 |
| ·生物信息学方法 | 第23页 |
| ·引物的设计和合成 | 第23页 |
| ·蛋白质结构和功能的分析 | 第23页 |
| 2.细胞生物学方法 | 第23-25页 |
| ·细胞培养和转染 | 第23-24页 |
| ·细胞复苏 | 第23页 |
| ·细胞传代及冻存 | 第23-24页 |
| ·细胞培养 | 第24页 |
| ·Lipofectamin 2000法转染 | 第24页 |
| ·β-半乳糖苷酶的组化分析 | 第24页 |
| ·绿色荧光蛋白表达的检测 | 第24页 |
| ·四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞毒作用 | 第24页 |
| ·流式细胞光度术分析 | 第24-25页 |
| 3.转基因小鼠的鉴定和鼠系的培育 | 第25页 |
| ·鼠尾基因组DNA的提取 | 第25页 |
| ·PCR鉴定和Southern杂交 | 第25页 |
| ·转基因鼠系的建立 | 第25页 |
| 4.ApoE转基因鼠的血脂测定 | 第25-26页 |
| ·总胆固醇测定 | 第25-26页 |
| ·甘油三脂测定 | 第26页 |
| 5.动物行为试验 | 第26页 |
| ·自发活动实验 | 第26页 |
| ·被动回避反应 | 第26页 |
| ·主动回避反应 | 第26页 |
| ·Y—迷宫实验 | 第26页 |
| 6.统计学处理 | 第26-28页 |
| 结果和讨论 | 第28-73页 |
| 第一部分 人突变APOE近交系转基因鼠系和相关疾病模型的建立 | 第28-43页 |
| ·首建鼠的鉴定 | 第28-29页 |
| ·转基因鼠系的建立和传代 | 第29-33页 |
| ·重组人apoE基因转基因鼠系F1代的培育 | 第29-30页 |
| ·重组人apoE基因转基因鼠系F2代纯合子的培育 | 第30-31页 |
| ·转基因鼠系的一般生物学特征 | 第31-33页 |
| ·概貌 | 第31-32页 |
| ·人apoE基因在转基因小鼠体内的组织特异性表达 | 第32-33页 |
| ·apoE转基因鼠的异常表现和应用 | 第33-38页 |
| ·异常人apoE_4和apoE_7基因表达与血脂水平的关系 | 第33-34页 |
| ·异常人apoE_4和apoE_7基因表达对转基因鼠脑认知功能的影响 | 第34-36页 |
| ·自发活动实验 | 第34页 |
| ·被动回避反应 | 第34页 |
| ·主动回避反应 | 第34-35页 |
| ·Y—迷宫自发变换实验 | 第35-36页 |
| ·应用apoE_4转基因鼠建立AD动物模型 | 第36-38页 |
| ·h-apoE_4／APP双转基因小鼠的鉴定 | 第36页 |
| ·h-apoE_4／APP双转基因小鼠的血脂检测 | 第36-37页 |
| ·h-apoE_4／APP双转基因小鼠自发变换行为的实验 | 第37-38页 |
| 讨论 | 第38-43页 |
| 1.apoE转基因鼠的制备及其高脂血症的表现 | 第38-40页 |
| 2.APOE,胆固醇水平与AD的关系 | 第40-41页 |
| 3.应用apoE转基因小鼠建立AD动物模型 | 第41-43页 |
| 第二部分 人突变APOE转基因小鼠基因表达特点的分析 | 第43-69页 |
| ·削减克隆的测序与同源性分析 | 第43-44页 |
| ·新EST在Genbank的登陆 | 第44-45页 |
| ·BM958514(克隆2007)的Northern杂交 | 第45-46页 |
| ·人apoE转基因小鼠差异表达新基因的筛选 | 第46-47页 |
| ·BM958514(克隆2007)同源EST的筛选和开放读码框架的推测 | 第46页 |
| ·BM958514开放读码框架的实验验证 | 第46-47页 |
| ·BM896420(克隆192)和BM958515(克隆2113)开放读码框架的推测和实验验证 | 第47页 |
| ·新基因QIL-1的克隆和功能的初步研究 | 第47-58页 |
| ·新基因QIL-1的克隆和测序 | 第47-50页 |
| ·QIL-1的同源性比较和电子定位 | 第50-52页 |
| ·蛋白质序列结构和功能的生物信息学分析 | 第52-53页 |
| ·OIL-1的多组织表达 | 第53-54页 |
| ·OIL-1功能的初步研究 | 第54-58页 |
| ·融合表达质粒pEGFP-QIL1的构建和鉴定 | 第54-55页 |
| ·pEGFP-QIL1在真核细胞中的表达 | 第55-56页 |
| ·RT-PCR检测QIL-1基因在EK293细胞中的表达 | 第56页 |
| ·细胞毒性测定 | 第56-57页 |
| ·流式细胞光度术(FCM)分析 | 第57-58页 |
| ·cDNA微阵列分析转基因小鼠基因表达谱的变化 | 第58-63页 |
| ·总RNA及cDNA探针的纯度 | 第58-59页 |
| ·转基因鼠肾脏基因表达水平的变化 | 第59-61页 |
| ·Northern杂交验证转基因鼠体内c-jun的表达 | 第61-63页 |
| 讨论 | 第63-69页 |
| 1.In silico gene cloning克隆OIL-1基因全长和其功能初步研究 | 第63-65页 |
| 2.转基因鼠的基因表达特点及其与表现型的关系 | 第65-69页 |
| (1) 氧化磷酸化过程 | 第65-66页 |
| (2) 炎症、免疫和凋亡过程 | 第66-68页 |
| (3) 细胞因子和信号传导过程 | 第68-69页 |
| 第三部分 重组人APOE基因神经细胞特异表达质粒的构建 | 第69-73页 |
| 1.重组人apoE基因神经细胞特异表达质粒pNE_4和pNE_7的构建 | 第69-71页 |
| ·人apoE_4和apoE_7基因组DNA与神经细胞特异表达启动子的重组 | 第69-71页 |
| ·重组质粒pNE_4和pNE_7的鉴定 | 第71页 |
| 2.重组质粒pNE_4和pNE_7在神经细胞中的表达 | 第71-73页 |
| ·重组人apoE基因质粒在PC12细胞中的瞬时表达 | 第71-72页 |
| ·重组人apoE基因质粒在PC12细胞中的稳定表达 | 第72-73页 |
| 小结 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 综述一 APOE基因的多态性和功能异常 | 第80-84页 |
| ApoE的结构和功能 | 第80页 |
| ApoE基因的多态性,突变体以及和高脂血症的关系 | 第80-82页 |
| ApoE基因多态性的分析方法 | 第82-84页 |
| 综述二 阿尔茨海默症的相关基因及功能异常 | 第84-94页 |
| 概述 | 第84页 |
| AD的临床表现和神经系统病变 | 第84-85页 |
| 影响AD的基因 | 第85-94页 |
| 英文名词及缩写 | 第94-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
