| 中文摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-14页 |
| 符号说明 | 第14-16页 |
| 目录 | 第16-21页 |
| 前言 | 第21-26页 |
| 1 研究背景、基础和目的意义 | 第21-23页 |
| 2 拟解决的问题 | 第23页 |
| 3 主要研究内容 | 第23-24页 |
| 4 整体技术路线 | 第24-26页 |
| 第一部分 文献综述 | 第26-49页 |
| 第一章 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗运载体研究进展 | 第26-39页 |
| 1 沙门菌的特征 | 第26-27页 |
| 2 沙门菌的侵染机制 | 第27-28页 |
| 3 沙门菌的减毒 | 第28-30页 |
| 4 减毒沙门菌的胞内定位及对基因疫苗的运送 | 第30-31页 |
| 5 运送基因疫苗减毒沙门菌诱发机体免疫应答的机制 | 第31页 |
| 6 减毒猪霍乱沙门菌作为疫苗的应用 | 第31-34页 |
| 7 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的应用 | 第34-37页 |
| 8 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的优点及潜在的威胁 | 第37-39页 |
| 第二章 猪瘟病毒研究进展 | 第39-49页 |
| 1 猪瘟病毒概述 | 第39页 |
| 2 猪瘟病毒的病原学研究 | 第39-41页 |
| 3 猪瘟病毒分子生物学研究 | 第41-44页 |
| 4 猪瘟病毒致细胞病变型的研究 | 第44页 |
| 5 猪瘟病毒疫苗研究 | 第44-47页 |
| 6 猪瘟病毒与动物性食品安全 | 第47-48页 |
| 7 小结 | 第48-49页 |
| 第二部分 实验研究 | 第49-170页 |
| 第一章 猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析 | 第49-67页 |
| 1 材料和方法 | 第49-57页 |
| ·实验材料 | 第49-50页 |
| ·实验方法 | 第50-57页 |
| ·技术路线 | 第50-51页 |
| ·引物的设计与合成 | 第51页 |
| ·S.C500细菌活化培养 | 第51页 |
| ·S.C500细菌基因DNA的提取制备 | 第51-52页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 | 第52-53页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子区域扩增产物的TA克隆 | 第53-55页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR产物的TA克隆质粒初步鉴定 | 第55-56页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子区域TA克隆质粒测序鉴定 | 第56页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子扩增区域的序列分析 | 第56-57页 |
| 2 结果与分析 | 第57-65页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 | 第57页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子序列TA克隆质粒鉴定 | 第57-58页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子序列测定及结果分析 | 第58页 |
| ·S.C500 nirB、pagC基因启动子序列的序列分析 | 第58-65页 |
| 3 讨论 | 第65-66页 |
| 4 本章小结 | 第66-67页 |
| 第二章 沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究 | 第67-81页 |
| 1 材料和方法 | 第67-73页 |
| ·实验材料 | 第67-68页 |
| ·实验方法 | 第68-73页 |
| ·技术路线 | 第68-69页 |
| ·引物设计与合成 | 第69-70页 |
| ·报告基因EGFP的质粒PCR扩增及TA克隆 | 第70页 |
| ·基因片段PnirB、PpagC的质粒PCR扩增及TA克隆 | 第70页 |
| ·含启动子PnirB、PpagC表达载体的构建 | 第70-71页 |
| ·含报告基因EGFP重组载体的构建 | 第71页 |
| ·报告基因EGFP在S.C500中的表达研究 | 第71-73页 |
| 2 结果与分析 | 第73-79页 |
| ·报告基因克隆质粒pUCX-EGFP构建 | 第73-74页 |
| ·目的基因克隆质粒pUCX-PnirB(PB)、pUCX-PpagC(PC)构建 | 第74-75页 |
| ·表达载体pPB、pPC构建 | 第75页 |
| ·报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP构建 | 第75-76页 |
| ·重组菌S.C500/pPB-EGFP、S.C500/pPC-EGFP的表达研究 | 第76-79页 |
| 3 讨论 | 第79-80页 |
| 4 本章小结 | 第80-81页 |
| 第三章 新型双功能通用表达载体的构建及启动活性研究 | 第81-98页 |
| 1 材料和方法 | 第81-87页 |
| ·实验材料 | 第81页 |
| ·实验方法 | 第81-87页 |
| ·技术路线 | 第81-82页 |
| ·引物设计与合成 | 第82-83页 |
| ·启动子基因PnirB(CB)、PpagC(CC)的PCR扩增及TA克隆 | 第83页 |
| ·新型基因疫苗表达载体的构建 | 第83-84页 |
| ·新型基因疫苗报告载体的构建 | 第84页 |
| ·新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 | 第84页 |
| ·新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中瞬时表达研究 | 第84-86页 |
| ·重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP的稳定性分析 | 第86页 |
| ·重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP在体外培养小鼠巨噬细胞中表达研究 | 第86-87页 |
| 2 结果与分析 | 第87-93页 |
| ·克隆质粒pUCX-PnirB(CB)、pUCX-PpagC(CC)的构建 | 第87-88页 |
| ·新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建 | 第88页 |
| ·新型基因疫苗报告载体的构建 | 第88-89页 |
| ·新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 | 第89-91页 |
| ·新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中表达研究 | 第91-92页 |
| ·重组菌体外培养稳定性 | 第92页 |
| ·重组菌感染体外培养小鼠巨噬细胞的荧光观察 | 第92-93页 |
| 3 讨论 | 第93-97页 |
| 4 本章小结 | 第97-98页 |
| 第四章 内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究 | 第98-110页 |
| 1 材料和方法 | 第98-102页 |
| ·实验材料 | 第98页 |
| ·实验方法 | 第98-102页 |
| ·技术路线 | 第98-99页 |
| ·引物的设计与合成 | 第99-100页 |
| ·内江猪IL-15基因的克隆和序列分析 | 第100-101页 |
| ·内江猪IL-15基因的原核表达研究 | 第101页 |
| ·原核表达产物的活性检测 | 第101-102页 |
| ·内江猪IL-15基因的免疫佐剂作用研究 | 第102页 |
| 2 结果与分析 | 第102-107页 |
| ·内江猪IL-15基因的RT-PCR扩增及TA克隆 | 第102-103页 |
| ·内江猪IL-15基因序列分析 | 第103-104页 |
| ·原核表达载体DMAL-pmIL15的构建 | 第104-105页 |
| ·原核表达条件优化及其产物Western blot分析 | 第105页 |
| ·融合表达产物的生物活性检测 | 第105页 |
| ·pIL-15基因的免疫增强作用 | 第105-107页 |
| 3 讨论 | 第107-109页 |
| 4 本章小结 | 第109-110页 |
| 第五章 猪瘟病毒E2基因的分子克隆与原核表达研究 | 第110-123页 |
| 1 材料和方法 | 第110-113页 |
| ·实验材料 | 第110-111页 |
| ·实验方法 | 第111-113页 |
| ·技术路线 | 第111页 |
| ·引物设计与合成 | 第111-112页 |
| ·CSFV-E2基因的分子克隆与序列分析 | 第112-113页 |
| ·CSFV-E2蛋白主要抗原区编码基因的TA克隆质粒构建 | 第113页 |
| ·原核重组表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 | 第113页 |
| ·pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)在大肠杆菌中的表达 | 第113页 |
| 2 结果与分析 | 第113-120页 |
| ·CSFV-E2基因的分子克隆 | 第114-115页 |
| ·CSFV-E2基因的序列分析 | 第115-117页 |
| ·克隆质粒pUCX-mE2(pe)、pUCX-E2(pe)的构建 | 第117页 |
| ·原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 | 第117-119页 |
| ·R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的SDS-PAGE分析 | 第119页 |
| ·R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的Western Blot分析 | 第119-120页 |
| 3 讨论 | 第120-122页 |
| 4 本章小结 | 第122-123页 |
| 第六章 猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究 | 第123-142页 |
| 1 材料和方法 | 第123-128页 |
| ·实验材料 | 第123-124页 |
| ·实验方法 | 第124-128页 |
| ·技术路线 | 第124页 |
| ·引物设计与合成 | 第124-125页 |
| ·CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 | 第125-126页 |
| ·融合双基因重组表达载体的构建 | 第126页 |
| ·pEGFP-dME2-IL-15在Vero细胞中的表达 | 第126页 |
| ·pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 | 第126页 |
| ·pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细胞中的瞬时表达研究 | 第126-128页 |
| 2 结果与分析 | 第128-135页 |
| ·CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 | 第128-129页 |
| ·融合双基因重组表达载体的构建 | 第129-130页 |
| ·pEGFP-ME2-IL-15在Vero细胞中的表达 | 第130-131页 |
| ·pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 | 第131-132页 |
| ·pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细的瞬时表达 | 第132-135页 |
| 3 讨论 | 第135-140页 |
| 4 本章小结 | 第140-142页 |
| 第七章 融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及免疫安全性研究 | 第142-154页 |
| 1 材料和方法 | 第142-145页 |
| ·实验材料 | 第142-143页 |
| ·实验方法 | 第143-145页 |
| ·引物设计与合成 | 第143页 |
| ·重组菌生长特性、生化特性、药敏特性及血清学特性鉴定 | 第143页 |
| ·重组菌体外增殖中重组质粒的稳定性 | 第143-144页 |
| ·携质粒SC500对ST细胞的粘附、侵袭力和增殖 | 第144-145页 |
| ·携质粒S.C500口服免疫BALB/c小鼠 | 第145页 |
| 2 结果与分析 | 第145-151页 |
| ·重组工程菌体外培养特性检测 | 第145页 |
| ·S.C500体外培养中质粒的稳定性 | 第145-146页 |
| ·携质粒S.C500对ST细胞的粘附、侵袭和增殖能力的影响 | 第146-148页 |
| ·携质粒S.C500免疫BALB/c小鼠 | 第148-151页 |
| 3 讨论 | 第151-153页 |
| 4 本章小结 | 第153-154页 |
| 第八章 融合双基因表达载体重组S.C500活菌疫苗口服接种家兔的体内免疫应答初步研究 | 第154-170页 |
| 1 材料和方法 | 第154-159页 |
| ·实验材料 | 第154-155页 |
| ·实验方法 | 第155-159页 |
| ·重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 | 第155页 |
| ·双基因融合表达载体重组工程菌的活化培养 | 第155页 |
| ·猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 | 第155-157页 |
| ·口服免疫重组工程菌菌液的制备 | 第157页 |
| ·试验家兔的口服免疫接种 | 第157页 |
| ·免疫家兔血清抗体水平检测 | 第157-158页 |
| ·免疫家兔T淋巴细胞增殖检测 | 第158页 |
| ·免疫后家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒试验 | 第158-159页 |
| ·免疫后家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 | 第159页 |
| 2 结果与分析 | 第159-166页 |
| ·重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 | 第159-160页 |
| ·猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 | 第160-162页 |
| ·免疫家兔抗CSFV特异性抗体的检测 | 第162-163页 |
| ·免疫家兔抗S.C500特异性抗体的检测 | 第163页 |
| ·免疫家兔T淋巴细胞增殖能力检测 | 第163-164页 |
| ·免疫家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒研究 | 第164-165页 |
| ·免疫家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 | 第165-166页 |
| 3 讨论 | 第166-168页 |
| 4 本章小结 | 第168-170页 |
| 第三部分 全文总结论 | 第170-172页 |
| 第四部分 本研究的创新点 | 第172-173页 |
| 第五部分 本研究的不足之处 | 第173页 |
| 第六部分 本研究的展望与建议 | 第173-174页 |
| 参考文献 | 第174-189页 |
| 致谢 | 第189-190页 |
| 作者简介 | 第190页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第190-191页 |
