| 提要 | 第1-7页 |
| 英文缩写词表 | 第7-15页 |
| 前言 | 第15-18页 |
| 第一篇 文献综述 | 第18-28页 |
| 第1章 肺炎克雷伯菌的研究概况 | 第18-24页 |
| ·流行病学 | 第18-19页 |
| ·耐药机制 | 第19-20页 |
| ·毒力因子 | 第20-23页 |
| ·荚膜多糖 | 第20-21页 |
| ·脂多糖 | 第21-22页 |
| ·粘附因子 | 第22页 |
| ·转铁结合蛋白 | 第22-23页 |
| ·防治措施 | 第23页 |
| ·结语 | 第23-24页 |
| 第2章 表位疫苗的构建与研究 | 第24-28页 |
| ·筛选鉴定 | 第24页 |
| ·选择表位 | 第24-25页 |
| ·构建设计 | 第25页 |
| ·优化 | 第25-27页 |
| ·Linker | 第25-26页 |
| ·结合能力 | 第26页 |
| ·定位靶向序列 | 第26-27页 |
| ·定位T、B 细胞表位 | 第27页 |
| ·遗传限制 | 第27页 |
| ·展望 | 第27-28页 |
| 第二篇 研究内容 | 第28-99页 |
| 第1章 肺炎克雷伯菌粘附素蛋白的基因克隆、表达及粘附阻断和免疫保护 | 第28-38页 |
| 1 材料 | 第28-29页 |
| ·菌株、表达载体与细胞株 | 第28页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第28-29页 |
| 2 方法 | 第29-32页 |
| ·融合蛋白的表达、纯化鉴定及GST 标签的切除 | 第29-30页 |
| ·MrkD 粘附活性检测 | 第30-31页 |
| ·免疫荧光双标记 | 第31-32页 |
| 3 结果 | 第32-36页 |
| ·MrkD 蛋白纯化 | 第32-33页 |
| ·MrkD 在肺炎克雷伯菌粘附中的作用 | 第33-35页 |
| ·激光共聚焦显微镜定位粘附蛋白 | 第35-36页 |
| ·GST-MrkD 免疫保护性试验 | 第36页 |
| 4 讨论 | 第36-37页 |
| ·关于肺炎克雷伯菌感染的防治 | 第36页 |
| ·关于肺炎克雷伯菌粘附素MrkD 蛋白的作用 | 第36-37页 |
| 5 小结 | 第37-38页 |
| ·本试验构建了 pGEX-4T-MrkD 重组质粒,表达了 GST-MrkD,经凝血酶酶切 作用及亲和层析技术纯化了 MrkD | 第37页 |
| ·研究了 MrkD 介导的肺炎克雷伯菌对 BEP-2D 细胞的粘附作用;证明 MrkD 可以显著影响肺炎克雷伯菌对 BEP-2D 细胞的粘附力 | 第37页 |
| ·研究了 GST-MrkD 作为抗原免疫 Balb/c 小鼠 | 第37-38页 |
| 第2章 抗 MrkD 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 | 第38-58页 |
| 1 材料 | 第38-39页 |
| ·主要仪器 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38-39页 |
| ·试验动物和细胞 | 第39页 |
| ·菌株 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-47页 |
| ·抗MrkD 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 | 第39-44页 |
| ·腹水制备单克隆抗体 | 第44页 |
| ·单克隆抗体的提纯 | 第44-45页 |
| ·杂交瘤细胞株及单克隆抗体的初步鉴定 | 第45-47页 |
| 3 结果 | 第47-54页 |
| ·免疫小鼠血清抗体效价 | 第47-48页 |
| ·酶标羊抗鼠抗体最佳工作浓度的选择 | 第48页 |
| ·抗原、抗体最适包被浓度测定 | 第48-49页 |
| ·建立杂交瘤细胞株 | 第49-50页 |
| ·单克隆抗体的初步鉴定 | 第50-54页 |
| 4 讨论 | 第54-57页 |
| ·关于抗原及动物免疫 | 第54页 |
| ·关于细胞融合 | 第54-55页 |
| ·关于杂交瘤细胞的筛选及克隆 | 第55页 |
| ·关于鉴定单克隆抗体亚类 | 第55-56页 |
| ·关于单克隆抗体的纯化及腹水中抗体蛋白含量 | 第56页 |
| ·单克隆抗体的亲和力和特异性 | 第56-57页 |
| 5 小结 | 第57-58页 |
| ·建立 1 株能稳定分泌肺炎克雷伯菌 MrkD 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | 第57页 |
| ·制备纯化腹水后,SDS-PAGE 电泳可见有两条带 | 第57页 |
| ·间接法测定单克隆抗体的相对亲和力 | 第57-58页 |
| 第3章 噬菌体随机肽库筛选鉴定 MrkD 蛋白的 B 细胞表位 | 第58-72页 |
| 1 材料 | 第58-59页 |
| ·试剂盒 | 第58页 |
| ·主要仪器 | 第58-59页 |
| ·噬菌体筛选所用试剂 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-66页 |
| ·噬菌体随机12 肽库的滴度测定 | 第59-60页 |
| ·亲和淘选 | 第60-62页 |
| ·淘选效率分析 | 第62页 |
| ·三轮淘选出的噬菌体克隆扩增 | 第62-63页 |
| ·噬菌体单链DNA 提取及序列测定 | 第63-64页 |
| ·对E01 m Ab 筛选的阳性噬菌体克隆进行ELISA 鉴定 | 第64-65页 |
| ·竞争抑制ELISA 试验 | 第65页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第65页 |
| ·Western-blot 试验 | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-70页 |
| ·筛选效率 | 第66-67页 |
| ·阳性噬菌体克隆的筛选和鉴定 | 第67页 |
| ·阳性克隆DNA 序列测定及编码氨基酸序列分析 | 第67-68页 |
| ·阳性噬菌体克隆抑制E01 m Ab 与MrkD 蛋白的结合 | 第68-69页 |
| ·噬菌体克隆诱导的免疫反应 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-71页 |
| ·关于抗原表位分析方法的选择 | 第70页 |
| ·关于模拟抗原表位 | 第70-71页 |
| ·关于表位疫苗的设计 | 第71页 |
| 5 小结 | 第71-72页 |
| 第4章 MrkD 蛋白的 H-2~d限制性 Th 表位的体外实验鉴定 | 第72-82页 |
| 1 材料 | 第72-74页 |
| ·实验动物 | 第72-73页 |
| ·主要试剂与溶液 | 第73页 |
| ·溶液配制 | 第73-74页 |
| 2 方法 | 第74-76页 |
| ·MrkD 的H-2d限制性Th 表位的预测 | 第74页 |
| ·候选表位多肽的合成与鉴定 | 第74页 |
| ·动物免疫 | 第74-75页 |
| ·淋巴细胞增殖实验 | 第75页 |
| ·流式细胞分析 | 第75页 |
| ·ELISA 检测细胞因子 | 第75页 |
| ·表位肽协同刺激实验 | 第75-76页 |
| ·ELISA 检测表位肽与鼠抗MrkD 及鼠抗K.pn 抗体的免疫反应性 | 第76页 |
| ·表位的三维结构位置分析 | 第76页 |
| ·统计学方法 | 第76页 |
| 3 结果 | 第76-80页 |
| ·MrkD 蛋白Th 表位肽预测与合成 | 第76-77页 |
| ·多肽刺激rMrkD 致敏的淋巴细胞增殖及表型分析 | 第77页 |
| ·ELISA 检测多肽刺激淋巴细胞增殖后的极化方向 | 第77-78页 |
| ·表位肽协同刺激实验 | 第78-79页 |
| ·ELISA 检测表位肽与鼠抗rMrkD 及鼠抗K.pn 血清的免疫反应性 | 第79-80页 |
| ·Th 表位在MrkD 蛋白三维结构上的分布 | 第80页 |
| 4 讨论 | 第80-81页 |
| ·关于Th 表位鉴定的意义 | 第80-81页 |
| ·关于软件预测结合实验鉴定表位的方法评价 | 第81页 |
| 5 小结 | 第81-82页 |
| 第5章 MrkD 蛋白的 H-2~d限制性 Th 表位的体内鉴定实验 | 第82-88页 |
| 1 材料 | 第82页 |
| ·主要试剂 | 第82页 |
| 2 方法 | 第82-85页 |
| ·动物免疫 | 第82页 |
| ·淋巴细胞增殖实验检测多肽免疫小鼠的细胞免疫应答 | 第82页 |
| ·RT-PCR 检测多肽免疫小鼠脾淋巴细胞的细胞因子表达 | 第82-85页 |
| ·统计学方法 | 第85页 |
| 3 结果 | 第85-86页 |
| ·多肽免疫后的小鼠淋巴细胞增殖实验 | 第85页 |
| ·多肽免疫后脾脏淋巴细胞因子的RT-PCR 检测 | 第85-86页 |
| 4 讨论 | 第86-87页 |
| ·关于MrkD 的Th 表位鉴定结果分析 | 第86-87页 |
| ·关于表位的协同作用 | 第87页 |
| 5 小结 | 第87-88页 |
| 第6章 B、Th 表位串联的设计构建及免疫原性研究 | 第88-99页 |
| 1 材料 | 第88页 |
| ·质粒及菌株 | 第88页 |
| ·实验动物 | 第88页 |
| ·主要试剂 | 第88页 |
| 2 方法 | 第88-93页 |
| ·K.pn 表位疫苗基因片段的选择和设计 | 第88-89页 |
| ·表位疫苗基因(epigene，简称epi)的合成及重组质粒的构建 | 第89页 |
| ·重组质粒的转化与筛选 | 第89-90页 |
| ·IPTG 诱导重组工程菌 BL21(DE3)表达 | 第90-91页 |
| ·重组蛋白EPI 的亲和层析纯化 | 第91页 |
| ·Lowry 法检测蛋白浓度 | 第91页 |
| ·动物免疫 | 第91-92页 |
| ·淋巴细胞增殖实验检测表位疫苗免疫小鼠的细胞免疫应答 | 第92页 |
| ·酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测表位疫苗特异性抗体 | 第92-93页 |
| ·统计学处理 | 第93页 |
| 3 结果 | 第93-97页 |
| ·表位疫苗的设计 | 第93页 |
| ·表位疫苗基因的合成 | 第93-94页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-epi 的酶切鉴定 | 第94页 |
| ·SDS-PAGE 检测重组蛋白EPI 的表达与纯化 | 第94-95页 |
| ·免疫小鼠脾细胞免疫应答检测 | 第95页 |
| ·表位疫苗免疫小鼠的血清抗体检测 | 第95-97页 |
| 4 讨论 | 第97-98页 |
| ·关于表位疫苗的设计 | 第97页 |
| ·关于表位疫苗的初步评价 | 第97-98页 |
| 5 小结 | 第98-99页 |
| 结论 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-120页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-123页 |
| 详细摘要 | 第123-125页 |
| Abstract | 第125-129页 |
| 导师及作者简介 | 第129-131页 |
| CURRICULUM VITAE | 第131页 |
