| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 引言 | 第11-16页 |
| 0.1 纳豆激酶简介 | 第11-14页 |
| 0.1.1 纳豆 | 第11页 |
| 0.1.2 纳豆激酶的发现 | 第11页 |
| 0.1.3 纳豆激酶的理化性质 | 第11-12页 |
| 0.1.4 纳豆激酶的药理学作用和机制 | 第12页 |
| 0.1.5 纳豆激酶的酶活检测方法 | 第12-13页 |
| 0.1.6 纳豆激酶的分子生物学结构 | 第13-14页 |
| 0.2 本实验研究的内容及目的 | 第14-16页 |
| 第一章 纳豆激酶原核表达 | 第16-25页 |
| 1.1 实验材料 | 第16页 |
| 1.1.1 引物合成 | 第16页 |
| 1.1.2 菌株、载体 | 第16页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第16页 |
| 1.1.4 主要溶液配制(见附录A) | 第16页 |
| 1.1.5 仪器及耗材(见附录B) | 第16页 |
| 1.2 实验方法 | 第16-21页 |
| 1.2.1 纳豆激酶前导肽和成熟肽酶原基因的酶切位点同义突变 | 第16-17页 |
| 1.2.2 NK-TC原核表达载体构建、蛋白表达及活性检测 | 第17-21页 |
| 1.3 结果 | 第21-24页 |
| 1.3.1 PCR扩增片段NK-TF与NK-TR | 第21页 |
| 1.3.2 重叠延伸PCR扩增片段NK-TC | 第21-22页 |
| 1.3.3 NK-TC原核表达载体构建、蛋白表达及酶活检测 | 第22-24页 |
| 1.4 讨论 | 第24-25页 |
| 第二章 纳豆激酶真核表达 | 第25-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第25页 |
| 2.1.1 引物合成 | 第25页 |
| 2.1.2 菌株、载体 | 第25页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第25页 |
| 2.1.4 主要溶液配制(见附录A) | 第25页 |
| 2.1.5 仪器及耗材(见附录B) | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-28页 |
| 2.2.1 NK-TC真核表达载体构建、蛋白表达及活性检测 | 第25-28页 |
| 2.3 结果 | 第28-31页 |
| 2.3.1 NK-TCPCR产物和pGAPZαA载体双酶切回收 | 第28-29页 |
| 2.3.2 菌落PCR鉴定酵母阳性转化子 | 第29页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE检测pGAPZαA-NK-TC蛋白表达 | 第29-30页 |
| 2.3.4 pGAPZαA-NK-TC蛋白酶活检测 | 第30-31页 |
| 2.4 讨论 | 第31-32页 |
| 第三章 定点突变修饰纳豆激酶热稳定性 | 第32-45页 |
| 3.1 实验材料 | 第32页 |
| 3.1.1 引物合成 | 第32页 |
| 3.1.2 菌株、载体 | 第32页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第32页 |
| 3.1.4 主要溶液配制(见附录A) | 第32页 |
| 3.1.5 仪器及耗材(见附录B) | 第32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-36页 |
| 3.2.1 纳豆激酶热稳定性氨基酸生物信息学预测分析 | 第32-33页 |
| 3.2.2 纳豆激酶(NK)前导肽和成熟肽酶原基因定点突变 | 第33-34页 |
| 3.2.3 NK-TC各个突变体原核表达载体构建、蛋白表达及活性检测 | 第34-36页 |
| 3.3 结果 | 第36-43页 |
| 3.3.1 生物信息学预测纳豆激酶热稳定性突变位点 | 第36-37页 |
| 3.3.2 NK-TC各个突变基因片段PCR扩增 | 第37-38页 |
| 3.3.3 重叠延伸PCR扩增各个突变体全长片段NK-T1/T2/T3 | 第38页 |
| 3.3.4 NK-TC各个突变体和载体pET-26b双酶切回收鉴定 | 第38-39页 |
| 3.3.5 重组载体pET-26b-NK-T1/T2/T3双酶切鉴定 | 第39页 |
| 3.3.6 突变体NK-T1/T2/T3蛋白表达检测 | 第39-40页 |
| 3.3.7 突变体NK-T1/T2/T3与突变前表达蛋白总含量检测 | 第40页 |
| 3.3.8 突变体NK-T1/T2/T3与突变前蛋白表达含量检测 | 第40-41页 |
| 3.3.9 突变体NK-T1/T2/T3蛋白活性检测 | 第41-42页 |
| 3.3.10 突变体NK-T1/T2/T3蛋白热稳定性检测 | 第42-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-45页 |
| 第四章 结论与展望 | 第45-47页 |
| 4.1 结论 | 第45页 |
| 4.2 展望 | 第45-47页 |
| 致谢 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-51页 |
| 附录 A 试剂及其配制一览表 | 第51-53页 |
| 附录 B 主要仪器与耗材一览表 | 第53-54页 |
| 附录 C 重组质粒目的片段的序列信息Blast结果 | 第54-57页 |
| 1.关于NK原核表达的片段信息blast结果 | 第54-55页 |
| 1-1 NK前导肽和成熟肽酶原基因的酶切位点同义突变 | 第54-55页 |
| 2.关于NK热稳定性各个突变体的片段信息blast结果 | 第55-57页 |
| 2-1 pET-26b-NK-T1 | 第55页 |
| 2-2 pET-26b-NK-T2 | 第55-56页 |
| 2-3 pET-26b-NK-T3 | 第56-57页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 | 第57-58页 |
