| 摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 引言 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-25页 |
| 1.1 蛋白质的定点修饰 | 第9-14页 |
| 1.1.1 定点修饰的方法 | 第9-11页 |
| 1.1.2 蛋白质生物素化修饰 | 第11-13页 |
| 1.1.3 生物素-链霉亲和素定点技术的应用 | 第13-14页 |
| 1.2 固定化酶 | 第14-17页 |
| 1.2.1 蛋白酶的固定化方式 | 第14-17页 |
| 1.2.2 固定化酶的应用 | 第17页 |
| 1.3 甲状旁腺激素 | 第17-20页 |
| 1.3.1 甲状旁腺激素概述 | 第17-18页 |
| 1.3.2 甲状旁腺激素代谢与慢性肾衰竭 | 第18-19页 |
| 1.3.3 甲状旁腺激素的检测 | 第19-20页 |
| 1.4 纳米抗体技术 | 第20-24页 |
| 1.4.1 纳米抗体概述 | 第20-22页 |
| 1.4.2 纳米抗体的应用 | 第22-23页 |
| 1.4.3 噬菌体展示库技术 | 第23-24页 |
| 1.4.4 抗PTH纳米抗体的筛选 | 第24页 |
| 1.5 本论文的研究目的、内容及意义 | 第24-25页 |
| 2 生物素连接酶的定点固载 | 第25-37页 |
| 2.1 引言 | 第25-26页 |
| 2.2 实验材料 | 第26-27页 |
| 2.2.1 材料与试剂 | 第26-27页 |
| 2.3 主要仪器和耗材 | 第27页 |
| 2.4 实验方法 | 第27-32页 |
| 2.4.1 BirA的表达和纯化 | 第27-29页 |
| 2.4.2 Avi tag底物的表达和纯化 | 第29-30页 |
| 2.4.3 BirA的定点固载 | 第30-31页 |
| 2.4.4 BirA酶催化活性检测 | 第31-32页 |
| 2.4.5 His标签位置对BirA固载的影响 | 第32页 |
| 2.4.6 EDTA对固定化BirA稳定性及活性的影响 | 第32页 |
| 2.4.7 咪唑浓度对固定化BirA催化过程的影响 | 第32页 |
| 2.5 实验结果及讨论 | 第32-36页 |
| 2.5.1 BirA酶和VAD-Avi-His的表达纯化与活性分析 | 第32-33页 |
| 2.5.2 H2O2对BirA固载效率和酶活性的影响 | 第33-34页 |
| 2.5.3 His标签位置对BirA固载的影响 | 第34-35页 |
| 2.5.4 EDTA和咪唑对固载BirA稳定性及活性的影响 | 第35-36页 |
| 2.6 小结 | 第36-37页 |
| 3 固定化生物素连接酶的评价及应用 | 第37-46页 |
| 3.1 引言 | 第37页 |
| 3.2 实验材料 | 第37-39页 |
| 3.2.1 材料与试剂 | 第37-38页 |
| 3.2.3 实验仪器及耗材 | 第38-39页 |
| 3.3 实验方法 | 第39-42页 |
| 3.3.1 HABA检测法 | 第39-40页 |
| 3.3.2 不同pH对固载酶稳定性的影响 | 第40页 |
| 3.3.3 不同温度对固载酶稳定性的影响 | 第40页 |
| 3.3.4 固载酶的重复使用及贮存时间 | 第40页 |
| 3.3.5 携带Avi标签PTH序列的设计及表达载体构建 | 第40-41页 |
| 3.3.6 PTH-Avi-His的表达与纯化 | 第41页 |
| 3.3.7 PTH-Avi-His生物素化 | 第41-42页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第42-45页 |
| 3.4.1 不同pH和温度处理对固载酶活性的影响 | 第42-43页 |
| 3.4.2 固定化酶的重复使用及贮存时间对酶活性影响 | 第43-44页 |
| 3.4.3 PTH-Avi-His的可溶表达及纯化 | 第44页 |
| 3.4.4 利用固定化BirA生物素化PTH-Avi-His | 第44-45页 |
| 3.5 小结 | 第45-46页 |
| 4 生物素-链霉亲和素体系筛选纳米抗体 | 第46-65页 |
| 4.1 引言 | 第46页 |
| 4.2 实验材料 | 第46-48页 |
| 4.2.1 材料与试剂 | 第47-48页 |
| 4.3 实验方法 | 第48-56页 |
| 4.3.1 PTH的表达纯化 | 第48页 |
| 4.3.2 测定噬菌体库的滴度 | 第48-49页 |
| 4.3.3 纳米抗体筛选步骤 | 第49-51页 |
| 4.3.4 噬菌体ELISA定性检测筛选结果 | 第51-52页 |
| 4.3.5 纳米抗体序列的获得 | 第52-53页 |
| 4.3.6 抗PTH纳米抗体表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 4.3.7 抗PTH纳米抗体的表达及分离纯化 | 第54页 |
| 4.3.8 利用Biacore测定纳米抗体亲和常数 | 第54-56页 |
| 4.3.9 抗PTH纳米抗体的ELISA活性检测 | 第56页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第56-63页 |
| 4.4.1 PTH的表达与纯化 | 第56-57页 |
| 4.4.2 噬菌体库的滴度测定结果 | 第57页 |
| 4.4.3 噬菌体库筛选抗PTH纳米抗体 | 第57-59页 |
| 4.4.4 PCR获取纳米抗体序列 | 第59-60页 |
| 4.4.5 序列分析结果 | 第60页 |
| 4.4.6 纳米抗体表达载体构建结果 | 第60-61页 |
| 4.4.7 目的蛋白的表达与纯化 | 第61-62页 |
| 4.4.8 纳米抗体亲和常数检测 | 第62-63页 |
| 4.4.9 ELISA检测纳米抗体的活性 | 第63页 |
| 4.5 小结 | 第63-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-71页 |
| 附录A His-BirA酶的序列设计 | 第71-72页 |
| 附录B PTH-Avi-His的序列设计 | 第72-73页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-76页 |
