| 摘要 | 第6-8页 |
| 英文摘要 | 第8-10页 |
| 缩略词 | 第16-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-41页 |
| 1.1 肿瘤和衰老 | 第17-21页 |
| 1.1.1 端粒与衰老 | 第18-19页 |
| 1.1.2 端粒,肿瘤以及细胞衰老的关系 | 第19-21页 |
| 1.2 DNA甲基化与肿瘤 | 第21-27页 |
| 1.2.1 DNA甲基化 | 第22-24页 |
| 1.2.2 DNA甲基化的调控 | 第24-26页 |
| 1.2.3 DNA甲基化与肿瘤 | 第26-27页 |
| 1.3 组蛋白修饰与DNA甲基化 | 第27-28页 |
| 1.3.1 组蛋白修饰简介 | 第27页 |
| 1.3.2 组蛋白修饰与DNA甲基化的相互促进 | 第27-28页 |
| 1.4 非编码RNA与肿瘤 | 第28-34页 |
| 1.4.1 miRNAs与DNA甲基化 | 第31页 |
| 1.4.2 miRNA表达影响DNA甲基化 | 第31-32页 |
| 1.4.3 DNA甲基化影响miRNA表达 | 第32-34页 |
| 1.5 p21~(waf1/cip1)结构与功能 | 第34-35页 |
| 1.5.1 p21~(waf1/cip1)结构 | 第34页 |
| 1.5.2 p21~(waf1/cip1)功能 | 第34-35页 |
| 1.6 p16~(Ink4a)结构与功能 | 第35页 |
| 1.6.1 p16~(Ink4a)结构 | 第35页 |
| 1.6.2 p16~(Ink4a)功能 | 第35页 |
| 1.7 Dicer的结构与功能 | 第35-38页 |
| 1.7.1 Dicer的结构 | 第35-36页 |
| 1.7.2 Dicer的功能 | 第36-38页 |
| 1.8 前期工作 | 第38-39页 |
| 1.9 实验设计 | 第39-41页 |
| 第二章 材料与方法 | 第41-72页 |
| 2.1 主要实验试剂和仪器 | 第41-43页 |
| 2.1.1 实验耗材及试剂 | 第41页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第41-43页 |
| 2.2 试剂的配制方法 | 第43-48页 |
| 2.3 Western Blot技术 | 第48-51页 |
| 2.3.1 样品蛋白的提取和蛋白浓度的测定 | 第48-49页 |
| 2.3.2 SDS-PAGE电泳 | 第49-50页 |
| 2.3.3 转膜 | 第50-51页 |
| 2.3.4 免疫杂交与显色 | 第51页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR | 第51-54页 |
| 2.4.1 细胞总RNA的提取 | 第51-52页 |
| 2.4.2 反转录cDNA | 第52-53页 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR分析转录水平的表达 | 第53-54页 |
| 2.5 细胞培养方法 | 第54-60页 |
| 2.5.1 细胞培养相关试剂配制 | 第54-57页 |
| 2.5.2 细胞的复苏 | 第57-58页 |
| 2.5.3 细胞的传代 | 第58页 |
| 2.5.4 细胞的冻存 | 第58-60页 |
| 2.6 无内毒素质粒提取 | 第60页 |
| 2.7 细胞的转染 | 第60页 |
| 2.8 RNAi技术 | 第60-61页 |
| 2.9 miRNA检测技术 | 第61-63页 |
| 2.10 细胞基因组DNA的提取 | 第63页 |
| 2.11 p16的甲基化水平检测 | 第63-67页 |
| 2.11.1 硫化测序PCR(Bisulfate sequencing PCR,BSP)技术 | 第63页 |
| 2.11.2 预测p16基因的CpG岛及BSP引物设计 | 第63-64页 |
| 2.11.3 重亚硫酸氢盐修饰DNA | 第64-65页 |
| 2.11.4 BSP-PCR扩增 | 第65-66页 |
| 2.11.5 TA克隆 | 第66-67页 |
| 2.12 ChIP(Chromatin immunoprecipitation) | 第67-69页 |
| 2.12.1 原理 | 第67页 |
| 2.12.2 溶液配方 | 第67-68页 |
| 2.12.3 实验方法 | 第68-69页 |
| 2.12.4 抗体和引物 | 第69页 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 | 第69-70页 |
| 2.13.1 实验原理 | 第69-70页 |
| 2.13.2 实验方法 | 第70页 |
| 2.14 细胞免疫荧光实验 | 第70-72页 |
| 2.14.1 实验原理 | 第70页 |
| 2.14.2 实验方法 | 第70-72页 |
| 第三章 实验结果 | 第72-88页 |
| 3.1 ALT肿瘤细胞395-3B-2中过表达外源p21可以诱导p16去甲基化而表达 | 第72-74页 |
| 3.2 395-3B-2细胞敲低Dicer并过表达p21后,p16启动子区域甲基化状态不变 | 第74-79页 |
| 3.2.1 成功构建Dicer-RNAi载体 | 第74-76页 |
| 3.2.2 395-3B-2+shDICER细胞系构建 | 第76-78页 |
| 3.2.3 395-3B-2+shDICER细胞过表达p21,p16启动子区域甲基化状态不变 | 第78-79页 |
| 3.3 395-3B-2细胞敲低Dicer后,细胞周期加快,但体内实验皮下注射SCID小鼠未能形成肿瘤 | 第79-81页 |
| 3.3.1 395-3B-2细胞敲低Dicer细胞周期进程加快 | 第79-80页 |
| 3.3.2 SCID小鼠皮下注射395-3B-2+shDICER细胞,未能形成肿瘤 | 第80-81页 |
| 3.4 395-3B-2细胞敲低Dicer,p-AKT激活,p21蛋白不能进入核,推测p21蛋白被磷酸化 | 第81-84页 |
| 3.5 395-3B-2细胞过表达p21,引起miR-152和miR-185表达上调 | 第84-85页 |
| 3.6 395-3B-2细胞过表达miR-152和miR-185,引起DNMT1表达下调,p16启动子区域发生去甲基化 | 第85-88页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第88-91页 |
| 4.1 总结 | 第88-89页 |
| 4.2 讨论 | 第89-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-98页 |
| 附录 攻读硕士期间发表论文目录 | 第98页 |
