| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| 英文缩略表 | 第11-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-20页 |
| 1.1 干酪的国内外发展现状 | 第12页 |
| 1.1.1 干酪 | 第12页 |
| 1.1.2 干酪国内外发展现状 | 第12页 |
| 1.2 凝乳酶简介 | 第12-16页 |
| 1.2.1 凝乳酶的结构和凝乳机理 | 第13-14页 |
| 1.2.2 凝乳酶的来源 | 第14-15页 |
| 1.2.3 重组凝乳酶在不同微生物表达系统中的研究 | 第15-16页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第16-17页 |
| 1.4 提高毕赤酵母中外源蛋白表达量的策略 | 第17-19页 |
| 1.4.1 外源基因密码子优化 | 第17页 |
| 1.4.2 启动子和信号肽选择 | 第17-18页 |
| 1.4.3 目的基因剂量对蛋白表达影响 | 第18页 |
| 1.4.4 融合标签蛋白表达 | 第18页 |
| 1.4.5 发酵条件优化 | 第18-19页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 密码子优化和融合蛋白对牛凝乳酶原表达量的影响 | 第20-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 培养基和溶剂的配制 | 第20页 |
| 2.1.3 试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.4 工具酶 | 第21页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-30页 |
| 2.2.1 表达载体pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14的构建 | 第21-25页 |
| 2.2.2 质粒pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14转化EcoliTrans1-T1感受态细胞 | 第25-26页 |
| 2.2.3 质粒pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14在毕赤酵母GS115中的表达 | 第26页 |
| 2.2.4 牛凝乳酶原基因在毕赤酵母GS115中的表达检测 | 第26-27页 |
| 2.2.5 摇瓶水平比较两种策略得到的高酶活菌株的表达情况 | 第27-28页 |
| 2.2.6 高酶活菌株转录水平分析和基因拷贝数测定 | 第28-30页 |
| 2.3 实验结果 | 第30-36页 |
| 2.3.1 牛凝乳酶原基因的优化 | 第30-31页 |
| 2.3.2 表达载体pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.3 重组质粒pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14转化毕赤酵母GS | 第32-33页 |
| 2.3.4 pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14重组毕赤酵母阳性菌株筛选 | 第33-35页 |
| 2.3.5 比较两种策略得到的最高酶活菌株的表达情况 | 第35-36页 |
| 2.3.6 不同策略得到的高酶活菌株转录水平和基因拷贝数分析 | 第36页 |
| 2.4 讨论 | 第36-38页 |
| 第三章 启动子的选择对毕赤酵母分泌牛凝乳酶原的影响 | 第38-44页 |
| 3.1 实验材料 | 第38页 |
| 3.2 实验方法 | 第38-39页 |
| 3.2.1 载体pGAPZα-clpcm14的构建和转化E.coliTrans1-T1感受态细胞 | 第38页 |
| 3.2.2 毕赤酵母GS115-H的构建 | 第38页 |
| 3.2.3 质粒pGAPZα-clpcm14在毕赤酵母GS115-H中的表达 | 第38页 |
| 3.2.4 组成型重组酵母菌株酶活表达检测 | 第38-39页 |
| 3.3 实验结果 | 第39-43页 |
| 3.3.1 载体pGAPZα-clpcm14的构建 | 第39-40页 |
| 3.3.2 毕赤酵母GS115-H的构建 | 第40-41页 |
| 3.3.3 质粒pGAPZα-clpcm14在毕赤酵母GS115-H中的表达 | 第41页 |
| 3.3.4 组成型重组牛凝乳酶原阳性菌株的筛选 | 第41-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-44页 |
| 第四章 毕赤酵母重组菌株的发酵培养及发酵条件的优化 | 第44-52页 |
| 4.1 材料 | 第44页 |
| 4.1.1 菌株 | 第44页 |
| 4.1.2 培养基及主要溶液的配制 | 第44页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第44页 |
| 4.1.4 实验设备及仪器 | 第44页 |
| 4.2 方法 | 第44-47页 |
| 4.2.1 菌株的发酵培养 | 第44-45页 |
| 4.2.2 组成型菌株GH-1的发酵条件的优化 | 第45-46页 |
| 4.2.3 组成型菌株GH-1的发酵过程中蛋白表达检测 | 第46-47页 |
| 4.3 结果 | 第47-51页 |
| 4.3.1 诱导型clp2-91和组成型GH-1重组酵母菌株的发酵结果 | 第47-48页 |
| 4.3.2 组成型GH-1重组酵母菌株发酵条件优化 | 第48-50页 |
| 4.3.3 组成型菌株GH-1发酵过程蛋白检测 | 第50-51页 |
| 4.4 讨论 | 第51-52页 |
| 第五章 全文结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 作者简历 | 第59页 |
