| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-34页 |
| 1.1 腈类化合物概述 | 第13-14页 |
| 1.2 腈水解酶概述 | 第14-17页 |
| 1.2.1 腈水解酶的来源及性质 | 第14-16页 |
| 1.2.2 腈水解酶的作用机制 | 第16-17页 |
| 1.3 蛋氨酸概述 | 第17-18页 |
| 1.3.1 蛋氨酸的性质 | 第17页 |
| 1.3.2 蛋氨酸的用途 | 第17页 |
| 1.3.3 蛋氨酸的市场现状 | 第17-18页 |
| 1.4 蛋氨酸生产工艺 | 第18-27页 |
| 1.4.1 化学法生产蛋氨酸 | 第18-22页 |
| 1.4.1.1 丙烯醛法 | 第18-20页 |
| 1.4.1.2 氨基内酯法 | 第20-21页 |
| 1.4.1.3 丙二酸酯法 | 第21页 |
| 1.4.1.4 固液相转移催化法 | 第21-22页 |
| 1.4.2 生物法生产蛋氨酸 | 第22-27页 |
| 1.4.2.1 酶拆分法制备L-蛋氨酸 | 第22-23页 |
| 1.4.2.2 发酵法生产蛋氨酸 | 第23-25页 |
| 1.4.2.3 化学-酶法生产蛋氨酸 | 第25-27页 |
| 1.5 论文的选题意义及研究内容 | 第27-28页 |
| 1.5.1 选题意义 | 第27页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第27-28页 |
| 参考文献 | 第28-34页 |
| 第二章 产腈水解酶基因工程菌的构建表达及酶学性质的研究 | 第34-54页 |
| 2.1 引言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料和方法 | 第35-41页 |
| 2.2.1 菌种、质粒及培养基 | 第35页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第35页 |
| 2.2.3 基因工程菌的构建 | 第35-39页 |
| 2.2.3.1 腈水解酶基因组的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.3.2 腈水解酶基因NIT的PCR扩增 | 第36页 |
| 2.2.3.3 水解酶基因NIT的克隆 | 第36-37页 |
| 2.2.3.4 大肠杆菌E.coli JM109感受态的制备 | 第37页 |
| 2.2.3.5 目的基因的转化 | 第37-38页 |
| 2.2.3.6 重组质粒的提取 | 第38页 |
| 2.2.3.7 重组表达质粒的构建 | 第38页 |
| 2.2.3.8 菌落PCR | 第38-39页 |
| 2.2.4 腈水解酶基因的诱导表达 | 第39页 |
| 2.2.5 酶活定义及检测 | 第39-40页 |
| 2.2.6 腈水解酶分离纯化及SDS-PAGE电泳分析 | 第40页 |
| 2.2.7 pH对酶活的影响 | 第40页 |
| 2.2.8 腈水解酶的pH稳定性 | 第40页 |
| 2.2.9 温度对酶活的影响 | 第40-41页 |
| 2.2.10 酶的温度稳定性 | 第41页 |
| 2.2.11 金属离子对酶活的影响 | 第41页 |
| 2.2.12 底物特异性 | 第41页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第41-52页 |
| 2.3.1 腈水解酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化 | 第41-43页 |
| 2.3.2 蛋白含量测定 | 第43页 |
| 2.3.3 分析检测方法的建立 | 第43-45页 |
| 2.3.4 重组腈水解酶活力测定 | 第45页 |
| 2.3.5 pH对酶活的影响 | 第45-46页 |
| 2.3.6 酶的pH稳定性 | 第46-47页 |
| 2.3.7 温度对酶活的影响 | 第47页 |
| 2.3.8 酶的温度稳定性 | 第47-49页 |
| 2.3.9 金属离子对酶活的影响 | 第49页 |
| 2.3.10 酶促反应动力学 | 第49-50页 |
| 2.3.11 底物特异性 | 第50-52页 |
| 2.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-54页 |
| 第三章 重组大肠杆菌J10-4产腈水解酶工艺条件优化 | 第54-67页 |
| 3.1 引言 | 第54页 |
| 3.2 材料与方法 | 第54-58页 |
| 3.2.1 菌种及初始培养基 | 第54-55页 |
| 3.2.2 主要实验仪器 | 第55页 |
| 3.2.3 细胞培养 | 第55页 |
| 3.2.4 酶活定义及转化条件 | 第55页 |
| 3.2.5 分析检测方法和生物量的测定 | 第55页 |
| 3.2.6 菌种培养时间 | 第55-56页 |
| 3.2.7 不同种类培养基对菌体生长以及产酶的影响 | 第56页 |
| 3.2.8 诱导剂种类和浓度对菌体生长和酶活的影响 | 第56页 |
| 3.2.9 诱导温度对菌体生长和酶活的影响 | 第56页 |
| 3.2.10 诱导时间对菌体生长和酶活的影响 | 第56-57页 |
| 3.2.11 初始pH对菌体生长和酶活的影响 | 第57页 |
| 3.2.12 摇瓶装液量对菌体生长和酶活的影响 | 第57页 |
| 3.2.13 接种量对菌体生长和酶活的影响 | 第57-58页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第58-65页 |
| 3.3.1 种子培养时间的确定 | 第58页 |
| 3.3.2 不同种类培养基对菌体生长以及产酶的影响 | 第58-59页 |
| 3.3.3 LB培养基成份优化 | 第59-60页 |
| 3.3.4 诱导剂种类和浓度对菌体生长和酶活的影响 | 第60-61页 |
| 3.3.5 诱导温度对菌体生长和酶活的影响 | 第61-62页 |
| 3.3.6 诱导时间对菌体生长和酶活的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.7 初始pH对菌体生长和酶活的影响 | 第63页 |
| 3.3.8 摇瓶装液量对菌体生长和酶活的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.9 接种量对菌体生长和酶活的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.10 摇瓶发酵菌体生长和产酶曲线 | 第65页 |
| 3.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-67页 |
| 第四章 静息细胞催化转化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备蛋氨酸条件优化 | 第67-81页 |
| 4.1 引言 | 第67页 |
| 4.2 材料与方法 | 第67-69页 |
| 4.2.1 菌种及培养基 | 第67-68页 |
| 4.2.2 细胞培养条件 | 第68页 |
| 4.2.3 微生物转化反应及酶活定义 | 第68页 |
| 4.2.4 转化pH值对酶活的影响 | 第68页 |
| 4.2.5 水解酶的pH稳定性 | 第68页 |
| 4.2.6 转化温度对酶活的影响 | 第68-69页 |
| 4.2.7 水解酶的热稳定性 | 第69页 |
| 4.2.8 金属离子对腈水解酶活性的影响 | 第69页 |
| 4.2.9 底物浓度对水解酶活性的影响 | 第69页 |
| 4.2.10 产物添加量对底物转化速率的影响 | 第69页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第69-79页 |
| 4.3.1 转化体系pH值对酶活的影响 | 第69-70页 |
| 4.3.2 腈水解酶的pH稳定性 | 第70-71页 |
| 4.3.3 转化温度对酶活的影响 | 第71-73页 |
| 4.3.4 水解酶的热稳定性 | 第73-75页 |
| 4.3.5 金属离子对菌体酶活性的影响 | 第75-76页 |
| 4.3.6 底物添加量对酶活性的影响 | 第76-77页 |
| 4.3.7 不同浓度底物的转化进程 | 第77-78页 |
| 4.3.8 产物浓度对底物转化速率的影响 | 第78-79页 |
| 4.4 总结 | 第79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 第五章 5L发酵罐产酶条件优化 | 第81-98页 |
| 5.1 引言 | 第81页 |
| 5.2 材料与方法 | 第81-84页 |
| 5.2.1 菌种及培养基 | 第81-82页 |
| 5.2.2 种子液培养 | 第82页 |
| 5.2.3 5L发酵罐初始培养条件 | 第82页 |
| 5.2.4 生物量测定 | 第82页 |
| 5.2.5 转化条件及酶活定义 | 第82页 |
| 5.2.6 葡萄糖的测定 | 第82-83页 |
| 5.2.7 初始葡萄糖浓度的优化 | 第83页 |
| 5.2.8 碳源补加对发酵的影响 | 第83页 |
| 5.2.9 氮源补加对发酵的影响 | 第83页 |
| 5.2.10 诱导时机和诱导剂浓度的优化 | 第83-84页 |
| 5.2.11 恒定pH补料对发酵的影响 | 第84页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第84-95页 |
| 5.3.1 葡萄糖标准曲线的测定 | 第84-85页 |
| 5.3.2 5L发酵罐分批发酵 | 第85页 |
| 5.3.3 选择分批补料发酵的依据 | 第85-86页 |
| 5.3.4 初始葡萄糖浓度的优化 | 第86-87页 |
| 5.3.5 碳源补加对发酵的影响 | 第87-89页 |
| 5.3.6 氮源补加对发酵的影响 | 第89-91页 |
| 5.3.7 诱导时机和诱导剂浓度的优化 | 第91-93页 |
| 5.3.8 恒定pH补料对发酵的影响 | 第93-94页 |
| 5.3.9 分批补料发酵稳定性实验 | 第94-95页 |
| 5.4 本章小结 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-98页 |
| 第六章 结论与展望 | 第98-101页 |
| 6.1 结论 | 第98-99页 |
| 6.2 展望 | 第99-101页 |
| 附录Ⅰ | 第101-102页 |
| 攻读硕士期间发表的论文 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
