| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-26页 |
| 1.1 氧化还原酶简介及分类 | 第11-12页 |
| 1.2 细胞色素P450单加氧酶 | 第12-17页 |
| 1.2.1 单加氧酶的结构 | 第12-13页 |
| 1.2.2 单加氧酶的分类 | 第13-14页 |
| 1.2.3 P450s催化反应机制及反应类型 | 第14-17页 |
| 1.2.3.1 P450s催化氧化反应机理 | 第14-16页 |
| 1.2.3.2 P450催化的反应类型 | 第16-17页 |
| 1.3 P450单加氧酶的应用 | 第17-22页 |
| 1.3.1 合成药物 | 第17-18页 |
| 1.3.2 合成药物代谢产物 | 第18-20页 |
| 1.3.3 化学酶法合成 | 第20-21页 |
| 1.3.4 生物修复 | 第21-22页 |
| 1.3.5 P450单加氧酶在应用中遇到的问题 | 第22页 |
| 1.4 自给自足型单加氧酶 | 第22-24页 |
| 1.4.1 自给自足型单加氧酶的研究现状 | 第22-23页 |
| 1.4.2 自给自足单加氧酶的优势 | 第23-24页 |
| 1.5 本课题的研究目的与意义 | 第24-25页 |
| 1.6 本课题主要研究内容 | 第25-26页 |
| 第2章 CYP116B家族单加氧酶的基因挖掘 | 第26-47页 |
| 2.1 引言 | 第26页 |
| 2.2 实验材料 | 第26-31页 |
| 2.2.0 试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第27-28页 |
| 2.2.2 仪器与设备 | 第28-29页 |
| 2.2.3 培养基 | 第29-30页 |
| 2.2.4 引物 | 第30-31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-39页 |
| 2.3.1 CYP116B家族单加氧酶的基因挖掘 | 第31页 |
| 2.3.2 基因来源菌种的培养 | 第31-32页 |
| 2.3.3 细菌基因组及质粒提取方法 | 第32页 |
| 2.3.4 重组质粒的构建 | 第32-36页 |
| 2.3.4.1 P450单加氧酶基因扩增 | 第33页 |
| 2.3.4.2 酶切及连接 | 第33-34页 |
| 2.3.4.3 转化 | 第34页 |
| 2.3.4.4 菌落PCR | 第34-35页 |
| 2.3.4.5 重组单加氧酶的表达和粗酶制备 | 第35页 |
| 2.3.4.6 核酸及蛋白电泳 | 第35-36页 |
| 2.3.5 CO差异色谱与P450单加氧酶浓度计算 | 第36页 |
| 2.3.6 还原酶活力测定 | 第36-37页 |
| 2.3.7 氧化酶的相对活力及选择性 | 第37-38页 |
| 2.3.7.1 对7-乙氧基香豆素的脱烷基活力 | 第37页 |
| 2.3.7.2 氧化硫醚的活性及选择性的测定 | 第37-38页 |
| 2.3.8 标准曲线的绘制 | 第38-39页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第39-45页 |
| 2.4.1 P450单加氧酶的基因挖掘 | 第39页 |
| 2.4.2 P450单加氧酶来源菌种的培养 | 第39-40页 |
| 2.4.3 基因组的提取 | 第40-41页 |
| 2.4.4 P450单加氧酶的克隆表达 | 第41-42页 |
| 2.4.5 还原酶活力和辅酶依赖性 | 第42-43页 |
| 2.4.6 CO差异色谱和P450浓度计算 | 第43-44页 |
| 2.4.7 氧化酶活力的比较 | 第44-45页 |
| 2.4.7.1 P450s对7-乙氧基香豆素的转化 | 第44-45页 |
| 2.4.7.2 P450s对对氯苯甲硫醚的转化率及选择性 | 第45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-47页 |
| 第3章 单加氧酶P450_(LaMO)的纯化与表征 | 第47-60页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料 | 第47页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第47页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第47页 |
| 3.3 实验方法 | 第47-51页 |
| 3.3.1 蛋白纯化 | 第47-48页 |
| 3.3.2 P450_(LaMO)纯酶活力及蛋白摩尔浓度的测定 | 第48页 |
| 3.3.3 P450_(LaMO)光谱学表征 | 第48-49页 |
| 3.3.3.1 紫外-可见光光谱分析 | 第49页 |
| 3.3.3.2 底物及抑制剂结合色谱 | 第49页 |
| 3.3.4 辅酶依赖型 | 第49-50页 |
| 3.3.5 温度对酶活的影响 | 第50页 |
| 3.3.6 pH对酶活的影响 | 第50页 |
| 3.3.7 添加剂(金属离子、EDTA)对酶活的影响 | 第50页 |
| 3.3.8 动力学常数的表征 | 第50-51页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第51-59页 |
| 3.4.1 P450_(LaMO)与同家族P450s序列比对及保守序列分析 | 第51-52页 |
| 3.4.2 重组单加氧酶P450_(LaMO)的表达纯化 | 第52页 |
| 3.4.3 蛋白分子量的测定 | 第52页 |
| 3.4.4 还原酶辅基类型的确定 | 第52-53页 |
| 3.4.5 P450_(LaMO)光谱学表征 | 第53-55页 |
| 3.4.6 辅酶依赖型的确定 | 第55-56页 |
| 3.4.7 P450_(LaMO)酶学性质的表征 | 第56-58页 |
| 3.4.7.1 温度对P450_(LaMO)酶活的影响 | 第56页 |
| 3.4.7.2 pH对P450_(LaMO)酶活的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.7.3 不同温度对酶稳定性的影响 | 第57页 |
| 3.4.7.4 添加剂对酶活的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.8 P450_(LaMO)对硫醚类底物的动力学表征 | 第58-59页 |
| 3.5 本章小结 | 第59-60页 |
| 第4章 P450_(LaMO)的底物谱研究 | 第60-69页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 实验材料 | 第60-61页 |
| 4.2.1 化学试剂 | 第60页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第60-61页 |
| 4.3 实验方法 | 第61-62页 |
| 4.3.1 P450_(LaMO)生物转化 | 第61页 |
| 4.3.1.1 P450_(LaMO)对硫醚底物的不对称氧化 | 第61页 |
| 4.3.1.2 其他反应类型的生物转化 | 第61页 |
| 4.3.2 产物检测及手性分析方法 | 第61-62页 |
| 4.3.2.1 产物亚砜的检测方法 | 第61页 |
| 4.3.2.2 其他反应类型检测方法 | 第61-62页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第62-68页 |
| 4.4.1 硫醚类反应底物谱 | 第62-64页 |
| 4.4.2 脱烷基反应底物谱 | 第64页 |
| 4.4.3 羟化反应底物谱 | 第64-67页 |
| 4.4.3.1 P450_(LaMO)对烷烃的羟化 | 第64-65页 |
| 4.4.3.2 P450_(LaMO)对二环化合物的羟化 | 第65-66页 |
| 4.4.3.3 P450_(LaMO)对萜类的羟化 | 第66-67页 |
| 4.4.4 环氧化反应底物谱 | 第67-68页 |
| 4.5 本章小结 | 第68-69页 |
| 第5章 总结与展望 | 第69-71页 |
| 5.1 全文总结与创新点 | 第69-70页 |
| 5.2 展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-80页 |
| 附录 | 第80-97页 |
| 攻读硕士期间撰写的论文和专利 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98页 |
