| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-22页 |
| 1.1 聚乙烯醇的概述 | 第11-12页 |
| 1.1.1 聚乙烯醇性质及应用 | 第11页 |
| 1.1.2 PVA 引发的问题和解决方法 | 第11-12页 |
| 1.2 生物降解PVA的研究进展 | 第12-15页 |
| 1.2.1 微生物降解 PVA | 第12-13页 |
| 1.2.2 PVA 降解酶 | 第13-15页 |
| 1.2.3 PVA 生物降解机理的研究 | 第15页 |
| 1.3 酶的蛋白质工程 | 第15-16页 |
| 1.4 酶的晶体学研究 | 第16-19页 |
| 1.4.1 蛋白质结晶的方法与原理 | 第16-17页 |
| 1.4.2 结晶条件的优化 | 第17页 |
| 1.4.3 蛋白质晶体数据的收集 | 第17页 |
| 1.4.4 解决相位问题 | 第17-19页 |
| 1.4.5 晶体结构解析和精修 | 第19页 |
| 1.5 本论文主要研究内容 | 第19-22页 |
| 1.5.1 生物法降解 PVA 存在的问题和本论文的研究意义 | 第19-21页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 OPH 在基因工程菌中的高效表达 | 第22-35页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 培养基 | 第22-23页 |
| 2.2.3 主要的实验试剂和仪器设备 | 第23页 |
| 2.2.4 不同来源的两段 OPH 基因的密码子优化 | 第23-24页 |
| 2.2.5 表达型质粒 pET20b(+)/soph 的构建 | 第24页 |
| 2.2.6 成熟 sOPH 在大肠杆菌中的表达和发酵条件优化 | 第24页 |
| 2.2.7 表达型质粒 pPIC9K/soph 的构建及转化 | 第24-25页 |
| 2.2.8 成熟 sOPH 在毕赤酵母中的表达 | 第25页 |
| 2.2.9 表达型质粒 pET32a(+)/poph 的构建 | 第25-26页 |
| 2.2.10 成熟 pOPH 在大肠杆菌中表达和初步纯化 | 第26页 |
| 2.2.11 蛋白电泳检测和 OPH 酶活的检测 | 第26页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第26-34页 |
| 2.3.1 不同来源的两段 OPH 基因的密码子优化 | 第26-27页 |
| 2.3.2 pET20b(+)/soph 的构建以及在大肠杆菌中的表达 | 第27-28页 |
| 2.3.3 重组大肠杆菌产 sOPH 的发酵条件优化 | 第28-30页 |
| 2.3.4 成熟 sOPH 在毕赤酵母表达 | 第30-32页 |
| 2.3.5 成熟 pOPH 在大肠杆菌中克隆表达和纯化 | 第32-34页 |
| 2.4 本章小结 | 第34-35页 |
| 第三章 sOPH 的纯化、结晶及相位解析 | 第35-48页 |
| 3.1 前言 | 第35页 |
| 3.2 材料与方法 | 第35-39页 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器设备 | 第35-37页 |
| 3.2.2 不同宿主表达 sOPH 蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 3.2.3 氧化型 PVA 水解酶（sOPH）样品的制备 | 第38页 |
| 3.2.4 sOPH 结晶条件的初筛 | 第38页 |
| 3.2.5 sOPH 结晶条件的优化 | 第38页 |
| 3.2.6 sOPH 晶体 X-光衍射数据的收集和处理 | 第38页 |
| 3.2.7 sOPH 活性区氨基酸突变体的制备 | 第38-39页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第39-47页 |
| 3.3.1 不同宿主表达 sOPH 蛋白的纯化 | 第39-41页 |
| 3.3.2 sOPH 晶体的初筛和优化 | 第41-43页 |
| 3.3.3 sOPH 晶体 X-光衍射结果 | 第43页 |
| 3.3.4 sOPH 晶体的重筛和优化 | 第43-45页 |
| 3.3.5 sOPH 晶体数据的收集 | 第45页 |
| 3.3.6 sOPH 相位角的解析 | 第45-47页 |
| 3.4 本章小结 | 第47-48页 |
| 第四章 pOPH 的纯化、结晶及相位解析 | 第48-62页 |
| 4.1 前言 | 第48页 |
| 4.2 材料与方法 | 第48-51页 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器设备 | 第48页 |
| 4.2.2 成熟 pOPH 的纯化 | 第48-50页 |
| 4.2.3 pOPH 纯酶的浓缩和纯度检验 | 第50页 |
| 4.2.4 pOPH 结晶条件的初筛和优化 | 第50页 |
| 4.2.5 pOPH 晶体衍射数据的收集和处理 | 第50页 |
| 4.2.6 pOPH 相位角的解析 | 第50-51页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第51-60页 |
| 4.3.1 成熟 pOPH 蛋白的纯化 | 第51-53页 |
| 4.3.2 pOPH 结晶条件的初筛 | 第53-54页 |
| 4.3.3 pOPH 晶体条件的优化及衍射数据的收集 | 第54-55页 |
| 4.3.4 pOPH 相位角的解析 | 第55-58页 |
| 4.3.5 突变体 pOPH S172C 的结构解析 | 第58-60页 |
| 4.4 本章小结 | 第60-62页 |
| 第五章 pOPH 和 sOPH 的晶体结构解析 | 第62-75页 |
| 5.1 前言 | 第62页 |
| 5.2 材料与方法 | 第62-64页 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器设备 | 第62页 |
| 5.2.2 sOPH 和 pOPH 的结构解析和精修 | 第62-63页 |
| 5.2.3 pOPH S172C 复合体的结构解析和精修 | 第63页 |
| 5.2.4 pOPH S172A 复合体的结构解析和精修 | 第63页 |
| 5.2.5 氧化型 PVA 模型的建立和酶催化机制的讨论 | 第63-64页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第64-73页 |
| 5.3.1 pOPH 和 sOPH 的结构解析 | 第64页 |
| 5.3.2 OPH 的整体结构特征 | 第64-66页 |
| 5.3.3 OPH 活性区内的小分子配体 | 第66-68页 |
| 5.3.4 pOPH S172C 复合体结构的解析 | 第68-70页 |
| 5.3.5 pOPH S172A 突变体蛋白的制备、结晶及结构解析 | 第70-71页 |
| 5.3.6 建立 OPA 模型和阐述水解催化机制 | 第71-73页 |
| 5.4 本章小结 | 第73-75页 |
| 第六章 基于 pOPH 结构的分子改造提高催化反应活力 | 第75-89页 |
| 6.1 前言 | 第75页 |
| 6.2 材料与方法 | 第75-77页 |
| 6.2.1 主要试剂和仪器设备 | 第75页 |
| 6.2.2 pOPH 相关突变体的克隆表达和纯化 | 第75-76页 |
| 6.2.3 pOPH 晶体与底物抑制剂的复合体数据的收集及精修 | 第76页 |
| 6.2.4 OPH 活性检测方法 | 第76-77页 |
| 6.2.5 分泌型质粒 pET20b(+)/poph 的构建及胞外表达 pOPH | 第77页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第77-87页 |
| 6.3.1 OPH 及活性区丝氨酸突变体对 OPA 的水解 | 第77-79页 |
| 6.3.2 pOPH 突变体蛋白的制备 | 第79-80页 |
| 6.3.3 突变体对 OPA 的反应动力学参数 | 第80-81页 |
| 6.3.4 组合突变体对 OPA 水解的反应动力学参数 | 第81页 |
| 6.3.5 组合突变体在大肠杆菌内的分泌表达 | 第81页 |
| 6.3.6 pOPH 和 sOPH 水解对硝基苯酚酯的分析 | 第81-83页 |
| 6.3.7 对 PNPB 低水解活性原因的讨论 | 第83-84页 |
| 6.3.8 盖子结构中的重要氨基酸 | 第84-87页 |
| 6.4 本章小结 | 第87-89页 |
| 主要结论与展望 | 第89-92页 |
| 主要结论 | 第89-91页 |
| 展望 | 第91-92页 |
| 论文创新点 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-106页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第106页 |
