| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 符号说明 | 第12-14页 |
| 文献综述 | 第14-29页 |
| 1 病原学 | 第14-17页 |
| 1.1 病原学分类与形态结构 | 第14-15页 |
| 1.2 RHDV基因组研究 | 第15-16页 |
| 1.3 RHDV主要结构蛋白VP60的研究 | 第16-17页 |
| 2 RHD流行病学 | 第17-18页 |
| 3 临床症状和病理变化 | 第18-19页 |
| 4 RHDV诊断 | 第19-24页 |
| 4.1 病理学检测 | 第19页 |
| 4.2 抗原诊断 | 第19-23页 |
| 4.2.1 红细胞凝集实验(HA) | 第19页 |
| 4.2.2 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第19-20页 |
| 4.2.3 电镜技术(EM) | 第20-21页 |
| 4.2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting) | 第21页 |
| 4.2.5 核酸检测 | 第21-22页 |
| 4.2.6 胶体金免疫层析技术 | 第22-23页 |
| 4.3 抗体检测 | 第23-24页 |
| 4.3.1 红细胞凝集抑制实验(HI) | 第23页 |
| 4.3.2 间接酶联免疫吸附试验(iELISA) | 第23-24页 |
| 5 RHDV防控 | 第24-27页 |
| 5.1 组织灭活苗 | 第24页 |
| 5.2 亚单位疫苗 | 第24-27页 |
| 5.2.1 利用大肠杆菌表达系统表达的亚单位疫苗 | 第24-25页 |
| 5.2.2 利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达的亚单位疫苗 | 第25-26页 |
| 5.2.3 利用毕赤酵母表达系统表达的亚单位疫苗 | 第26页 |
| 5.2.4 利用转基因植物表达系统表达的亚单位疫苗 | 第26页 |
| 5.2.5 重组病毒活载体疫苗 | 第26-27页 |
| 6 兽用生物质制品国家标准物质现状 | 第27-29页 |
| 6.1 OIE兔出血症病毒检测技术标准 | 第27页 |
| 6.2 生物标准物质的概念和发展现状 | 第27-29页 |
| 研究内容一 兔出血症病毒单克隆抗体的研制 | 第29-56页 |
| 1 材料 | 第29-32页 |
| 1.1 生物材料、载体与实验动物 | 第29页 |
| 1.2 主要试剂、仪器 | 第29-32页 |
| 2. 方法 | 第32-44页 |
| 2.1 免疫抗原的制备 | 第32-33页 |
| 2.1.1 扩增重组杆状病毒pBlueBacHis2B-VP60 | 第32页 |
| 2.1.2 间接免疫荧光检测重组蛋白在sf9细胞中表达 | 第32页 |
| 2.1.3 重组杆状病毒pBlueBacHis2B-VP60的TCID_(50)的测定 | 第32-33页 |
| 2.1.4 重组杆状病毒pBlueBacHis2B-VP60大量感染sf9细胞 | 第33页 |
| 2.2 RHDV VP60蛋白的原核表达 | 第33-38页 |
| 2.2.1 引物设计及目的片段的扩增 | 第33-34页 |
| 2.2.2 目的片段的克隆 | 第34页 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 | 第34-35页 |
| 2.2.4 阳性质粒的提取及鉴定 | 第35页 |
| 2.2.5 RHDV VP60基因原核表达载体的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.6 重组蛋白GST-VP60的诱导表达 | 第37页 |
| 2.2.7 重组蛋白GST-VP60蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.8 Western-blot鉴定重组蛋白GST-VP60抗原性 | 第38页 |
| 2.3 抗RHDV VP60单克隆抗体的制备 | 第38-44页 |
| 2.3.1 动物免疫 | 第39页 |
| 2.3.2 细胞融合的准备 | 第39-40页 |
| 2.3.3 细胞融合 | 第40页 |
| 2.3.4 阳性克隆筛选方法的建立 | 第40-41页 |
| 2.3.5 阳性杂交瘤的筛选 | 第41页 |
| 2.3.6 阳性杂交瘤的亚克隆及冻存 | 第41-42页 |
| 2.3.7 单克隆抗体的特性鉴定 | 第42-43页 |
| 2.3.8 腹水的制备及纯化 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-54页 |
| 3.1 免疫抗原的制备 | 第44-46页 |
| 3.1.1 间接免疫荧光(IFA)检测重组蛋白在sf9细胞中表达 | 第44-45页 |
| 3.1.2 IFA测定pBlueBacHis2B-VP60的TCID50以及重组蛋白大量制备 | 第45-46页 |
| 3.2 RHDV VP60原核表达 | 第46-49页 |
| 3.2.1 RHDV VP60基因的扩增 | 第46页 |
| 3.2.2 RHDV VP60原核表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.3 重组蛋白的诱导表达 | 第47-48页 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化及抗原性鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3 抗RHDV VP60单克隆抗体的制备 | 第49-54页 |
| 3.3.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选 | 第49-50页 |
| 3.3.2 单克隆抗体亚型鉴定 | 第50页 |
| 3.3.3 单克隆抗体与全病毒反应性 | 第50-51页 |
| 3.3.4 IFA验证单抗与重组杆状病毒表达的VP60反应性 | 第51-52页 |
| 3.3.5 抗体纯化效果 | 第52-54页 |
| 4 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 研究内容二 兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法的初步建立 | 第56-67页 |
| 1 材料 | 第56-57页 |
| 1.1 生物材料 | 第56页 |
| 1.2 主要仪器、试剂 | 第56-57页 |
| 2 方法 | 第57-59页 |
| 2.1 抗体的标记 | 第57页 |
| 2.2 抗体间夹心配对组合的选择 | 第57-58页 |
| 2.3 捕捉抗体和酶标抗体工作浓度的摸索 | 第58页 |
| 2.4 待检抗原最佳孵育时间的摸索 | 第58页 |
| 2.5 酶标抗体最佳孵育时间的摸索 | 第58-59页 |
| 2.6 底物作用时间的摸索 | 第59页 |
| 2.7 双夹心ELISA方法判断标准的确定 | 第59页 |
| 2.8 双夹心ELISA方法灵敏度试验 | 第59页 |
| 3 结果 | 第59-65页 |
| 3.1 捕捉和酶标抗体组合的确定 | 第59-61页 |
| 3.2 捕捉抗体和酶标抗体工作浓度的确定 | 第61-62页 |
| 3.3 待检抗原最佳孵育时间的摸索 | 第62-63页 |
| 3.4 酶标抗体最佳孵育时间的摸索 | 第63页 |
| 3.5 底物作用时间的摸索 | 第63-64页 |
| 3.6 阳性判定标准的确定 | 第64页 |
| 3.7 双夹心ELISA方法灵敏度试验 | 第64-65页 |
| 4 小结与讨论 | 第65-67页 |
| 研究内容三 兔出血症病毒标准抗原和标准抗体的研制 | 第67-82页 |
| 1 材料 | 第67-68页 |
| 1.1 生物材料、实验动物 | 第67页 |
| 1.2 主要仪器和试剂 | 第67-68页 |
| 2 方法 | 第68-74页 |
| 2.1 RHDV标准抗原的制备 | 第68-69页 |
| 2.1.1 病毒扩增 | 第68-69页 |
| 2.1.2 病毒肝脏上清血凝价的测定 | 第69页 |
| 2.1.3 RHDV病毒灭活,分装及安全性评价 | 第69页 |
| 2.2 RHDV多抗血清的制备 | 第69-70页 |
| 2.3 兔出血症病毒标准物质的鉴定 | 第70-73页 |
| 2.3.1 标准抗原的VP60基因鉴定 | 第70页 |
| 2.3.2 标准抗原的纯粹性鉴定 | 第70-72页 |
| 2.3.3 冻干前后标准抗原血凝价的测定 | 第72页 |
| 2.3.4 冻干前后标准抗体血凝抑制价的测定 | 第72页 |
| 2.3.5 标准抗体特异性鉴定 | 第72-73页 |
| 2.4 兔出血症病毒标准物质的其他检测 | 第73-74页 |
| 2.4.1 物理性状检查 | 第73页 |
| 2.4.2 装量差异系数分析 | 第73页 |
| 2.4.3 无菌检验 | 第73页 |
| 2.4.4 支原体检验 | 第73-74页 |
| 2.4.5 均一性 | 第74页 |
| 2.4.6 冻融稳定性 | 第74页 |
| 2.4.7 长期性保存 | 第74页 |
| 3. 结果 | 第74-81页 |
| 3.0 标准抗原的分装 | 第74页 |
| 3.1 标准抗原的安全性评价 | 第74-75页 |
| 3.2 标准抗原的VP60基因鉴定 | 第75页 |
| 3.3 标准抗原的纯粹性鉴定 | 第75-76页 |
| 3.4 冻干前后标准抗原血凝价的测定 | 第76页 |
| 3.5 标准抗体的分装 | 第76页 |
| 3.6 冻干前后标准抗体血凝抑制效价的测定 | 第76-77页 |
| 3.7 标准抗体特异性鉴定 | 第77页 |
| 3.8 标准物质物理性状检查 | 第77页 |
| 3.9 标准物质装量差异系数分析 | 第77页 |
| 3.10 标准物质无菌检验 | 第77-78页 |
| 3.11 标准物质支原体检验 | 第78页 |
| 3.12 标准物质均一性检验 | 第78-79页 |
| 3.13 标准物质冻融稳定性检验 | 第79页 |
| 3.14 标准物质保存期实验 | 第79-81页 |
| 4 小结与讨论 | 第81-82页 |
| 全文小结 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
