| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-12页 |
| 第一部分 文献综述及研究目的和意义 | 第12-20页 |
| 1 林麝研究概况 | 第12页 |
| 2 林麝肺炎及化脓性疾病研究概况 | 第12-13页 |
| 3 林麝肺源致病性大肠杆菌的研究概况 | 第13-14页 |
| 4 微生物敲除技术的研究概况 | 第14-19页 |
| 4.1 RecA重组系统 | 第15-16页 |
| 4.2 Red重组系统 | 第16-17页 |
| 4.3 新兴的基因敲除技术 | 第17-19页 |
| 4.3.1 TALENs靶向基因修饰技术 | 第17-18页 |
| 4.3.2 CRISPR/Cas9基因敲除技术 | 第18-19页 |
| 5 研究的目的与意义 | 第19-20页 |
| 第二部分 研究内容 | 第20-53页 |
| 第一章 林麝LPEC O血清型鉴定及部分耐药基因的PCR检测 | 第20-31页 |
| 1 实验材料 | 第20-21页 |
| 1.1 试验菌株 | 第20页 |
| 1.2 主要试剂 | 第20-21页 |
| 1.3 主要仪器 | 第21页 |
| 1.4 引物设计与合成 | 第21页 |
| 2 实验方法 | 第21-24页 |
| 2.1 菌种的复苏 | 第21页 |
| 2.2 PCR模板的制备 | 第21-23页 |
| 2.2.1 细菌基因组DNA的提取 | 第21-23页 |
| 2.2.2 细菌质粒的提取 | 第23页 |
| 2.3 大肠杆菌O血清型鉴定 | 第23页 |
| 2.4 耐药基因的PCR检测 | 第23-24页 |
| 2.5 O血清型与耐药基因的相关性分析 | 第24页 |
| 3 实验结果 | 第24-28页 |
| 3.1 大肠杆菌O血清型鉴定 | 第24页 |
| 3.2 耐药基因PCR扩增产物的电泳结果 | 第24-26页 |
| 3.3 耐药基因PCR扩增产物测序及分析 | 第26页 |
| 3.4 耐药基因检测结果 | 第26-28页 |
| 3.5 血清型与耐药基因相关性分析 | 第28页 |
| 4 讨论 | 第28-31页 |
| 4.1 林麝LPEC的O血清型鉴定 | 第28-29页 |
| 4.2 林麝LPEC的部分耐药基因检测 | 第29-30页 |
| 4.3 林麝LPEC耐药表型与耐药基因型的符合率 | 第30-31页 |
| 第二章 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的构建及其生物学特性研究 | 第31-53页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| 1.1 菌株与质粒及实验动物 | 第31页 |
| 1.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 1.3 主要仪器 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-40页 |
| 2.1 λ-Red同源重组中突变株引物的设计 | 第32页 |
| 2.2 pKD46质粒zeocin抗性改造 | 第32-36页 |
| 2.2.1 pGAPZα-A和pKD46质粒提取 | 第34页 |
| 2.2.2 zeocin基因PCR扩增 | 第34页 |
| 2.2.3 zeocin基因纯化与加A尾 | 第34-35页 |
| 2.2.4 DH5α感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 2.2.5 zeocin基因与T载体的连接转化 | 第35-36页 |
| 2.2.6 pKD46-zeo~+重组质粒的构建 | 第36页 |
| 2.3 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的构建 | 第36-39页 |
| 2.3.1 同源重组片段PCR产物的制备与回收 | 第36-37页 |
| 2.3.2 重组质粒pKD46-zeo~+向LPEC O78转化 | 第37页 |
| 2.3.3 电转化感受态细胞的制备 | 第37-38页 |
| 2.3.4 同源重组片段的电转化 | 第38页 |
| 2.3.5 LPEC O78(kan~r)-crl~-卡那霉素抗性基因的消除 | 第38页 |
| 2.3.6 缺失株LPEC O78-crl~-的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的生长特性研究 | 第39页 |
| 2.4.1 生化特性的测定 | 第39页 |
| 2.4.2 生长曲线的测定 | 第39页 |
| 2.5 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的毒力特性研究 | 第39-40页 |
| 2.5.1 半数致死量(LD_(50))的测定 | 第39页 |
| 2.5.2 病理形态学观察 | 第39-40页 |
| 2.6 红细胞凝集试验 | 第40页 |
| 2.6.1 2%红细胞悬液制备 | 第40页 |
| 2.6.2 红细胞凝集试验 | 第40页 |
| 3 试验结果 | 第40-50页 |
| 3.1 pKD46质粒zeocin抗性改造 | 第40-43页 |
| 3.1.1 pUCm-T/zeo~+重组质粒构建 | 第40-42页 |
| 3.1.2 pKD46-zeo~+重组质粒的构建 | 第42-43页 |
| 3.2 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的构建 | 第43-46页 |
| 3.2.1 同源重组片的PCR扩增 | 第43-45页 |
| 3.2.2 LPEC O78/pKD46-zeo~+的筛选与鉴定结果 | 第45页 |
| 3.2.3 电转化重组菌的筛选与鉴定结果 | 第45-46页 |
| 3.2.4 卡那霉素抗性基因的消除 | 第46页 |
| 3.3 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株生长特性测定 | 第46-47页 |
| 3.3.1 生化特性测定 | 第46-47页 |
| 3.3.2 生长曲线测定 | 第47页 |
| 3.4 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株毒力特性研究 | 第47-49页 |
| 3.4.1 半数致死量(LD_(50))的测定 | 第47-48页 |
| 3.4.2 病理形态学观察 | 第48-49页 |
| 3.5 红细胞凝集试验 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-53页 |
| 4.1 pKD46-zeo~+质粒的构建 | 第50-51页 |
| 4.2 缺失株LPEC O78-crl~-的构建 | 第51页 |
| 4.3 缺失株LPEC O78-crl~-的生长特性 | 第51页 |
| 4.4 缺失株LPEC O78-crl~-的毒力特性 | 第51-53页 |
| 第三部分 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 附录 | 第63-65页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第65页 |
