| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 文献综述 | 第13-21页 |
| 第一章 布鲁菌病及其检测技术 | 第13-21页 |
| 1.1 布鲁菌病病原学 | 第13-14页 |
| 1.2 布鲁菌病流行病学 | 第14-15页 |
| 1.3 布鲁菌病检测方法研究进展 | 第15-18页 |
| 1.3.1 病原学检测方法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 血清学检测方法 | 第16-17页 |
| 1.3.2.1 全乳环状实验(MRT) | 第16页 |
| 1.3.2.2 试管凝集实验(SAT) | 第16页 |
| 1.3.2.3 虎红平板凝集实验(RBPT) | 第16页 |
| 1.3.2.4 补体结合实验(CFT) | 第16页 |
| 1.3.2.5 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第16-17页 |
| 1.3.2.6 荧光偏振试验(FPA) | 第17页 |
| 1.3.2.7 胶体金免疫层析法(GICA) | 第17页 |
| 1.3.3 分子生物学检测方法 | 第17-18页 |
| 1.3.3.1 PCR检测法 | 第17-18页 |
| 1.3.3.2 荧光定量PCR检测法 | 第18页 |
| 1.3.3.3 环介导等温扩增技术(LAMP) | 第18页 |
| 1.4 布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28研究进展 | 第18-19页 |
| 1.5 本研究目的意义 | 第19-21页 |
| 试验研究 | 第21-51页 |
| 第二章 布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的原核表达 | 第21-37页 |
| 2.1 材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 菌种和载体 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂及相关溶液 | 第21-22页 |
| 2.1.3 主要使用仪器 | 第22-23页 |
| 2.2 方法 | 第23-31页 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 | 第23页 |
| 2.2.2 OMP19、OMP22、OMP28基因的扩增 | 第23-24页 |
| 2.2.3 目的基因片段的回收 | 第24页 |
| 2.2.4 原核表达载体pCold-TF的抽提 | 第24-25页 |
| 2.2.5 原核载体与目的基因的双酶切 | 第25-26页 |
| 2.2.6 原核表达载体与目的基因的连接与克隆 | 第26-27页 |
| 2.2.7 重组质粒的阳性鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.7.1 重组质粒的PCR鉴定 | 第27页 |
| 2.2.7.2 重组质粒的双酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.8 重组蛋白的诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.9 重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第28-29页 |
| 2.2.10 重组表达蛋白的反应原性分析 | 第29页 |
| 2.2.11 OMP19、OMP22、OMP28重组蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.12 测定纯化蛋白的浓度 | 第30-31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-35页 |
| 2.3.1 OMP19、OMP22、OMP28重组表达载体的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.2 重组表达质粒的双酶切鉴定结果 | 第32-33页 |
| 2.3.3 重组质粒的序列测定 | 第33页 |
| 2.3.4 重组蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析 | 第33-35页 |
| 2.4 讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 基于布鲁菌OMP19、OMP22和OMP28三种重组蛋白的iELISA方法研究 | 第37-51页 |
| 3.1 材料 | 第37页 |
| 3.1.1 血清、二抗 | 第37页 |
| 3.1.2 主要试剂及相关溶液 | 第37页 |
| 3.2 方法 | 第37-40页 |
| 3.2.1 选择最适的混合抗原包被浓度和酶标二抗稀释度 | 第37-38页 |
| 3.2.2 选择最适的一抗稀释度 | 第38页 |
| 3.2.3 选择最适的包被条件 | 第38页 |
| 3.2.4 选择最适的封闭液 | 第38页 |
| 3.2.5 选择封闭时间 | 第38页 |
| 3.2.6 选择最适的一抗反应时间 | 第38页 |
| 3.2.7 选择酶标最适的二抗反应时间 | 第38-39页 |
| 3.2.8 选择最适的显色液和显色时间 | 第39页 |
| 3.2.9 选择最适的终止条件 | 第39页 |
| 3.2.10 确定临界值(cut off value) | 第39页 |
| 3.2.11 特异性试验 | 第39页 |
| 3.2.12 灵敏度试验 | 第39页 |
| 3.2.13 重复性试验 | 第39页 |
| 3.2.14 样品检测与评价 | 第39-40页 |
| 3.2.14.1 iELISA检测 | 第40页 |
| 3.2.14.2 RBPT检测 | 第40页 |
| 3.2.14.3 IDEXX试剂盒检测 | 第40页 |
| 3.2.14.4 数据比较 | 第40页 |
| 3.3 结果与分析 | 第40-48页 |
| 3.3.1 最适抗原包被浓度和酶标二抗最适稀释度的确定 | 第40-41页 |
| 3.3.2 最适一抗稀释度的选择结果 | 第41页 |
| 3.3.3 最适包被条件的选择结果 | 第41-42页 |
| 3.3.4 最适封闭液的选择结果 | 第42-43页 |
| 3.3.5 最适封闭时间的选择结果 | 第43页 |
| 3.3.6 最适一抗反应时间的选择结果 | 第43-44页 |
| 3.3.7 最适酶标二抗反应时间的选择结果 | 第44页 |
| 3.3.8 最适显色液和显色时间的选择结果 | 第44-45页 |
| 3.3.9 最适终止条件的选择结果 | 第45-46页 |
| 3.3.10 确定临界值(cut off value) | 第46页 |
| 3.3.11 特异性试验结果 | 第46页 |
| 3.3.12 灵敏性试验结果 | 第46-47页 |
| 3.3.13 重复性试验结果 | 第47页 |
| 3.3.14 评价试验结果 | 第47-48页 |
| 3.4 讨论 | 第48-51页 |
| 结论部分 | 第51-52页 |
| 第四章 试验结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
