| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-32页 |
| 1 红曲霉概述 | 第16-17页 |
| ·红曲与红曲霉 | 第16页 |
| ·红曲霉的研究进展及应用 | 第16-17页 |
| 2 GABA概述 | 第17-20页 |
| ·GABA的理化性质及生理功能 | 第17-19页 |
| ·GABA的代谢途径 | 第19-20页 |
| 3 桔霉素概述 | 第20-22页 |
| ·桔霉素的理化性质及生理功能 | 第20-21页 |
| ·桔霉素的代谢途径 | 第21-22页 |
| 4 丝状真菌遗传转化研究概述 | 第22-24页 |
| 5 根癌农杆菌介导真菌转化(ATMT)技术概述 | 第24-28页 |
| ·根癌农杆菌的特性与应用 | 第24页 |
| ·根癌农杆菌介导真菌转化（ATMT)的原理 | 第24-25页 |
| ·ATMT法的步骤与关键条件 | 第25-28页 |
| ·真菌的培养时间 | 第25页 |
| ·诱导剂乙酰丁香酮浓度 | 第25-26页 |
| ·AGL-1菌株与真菌共培养时间和温度 | 第26-27页 |
| ·农杆菌菌液浓度与真菌孢子数比例 | 第27页 |
| ·其他影响因素 | 第27-28页 |
| 6 热不对称交错PCR技术概述 | 第28-30页 |
| ·TAIL-PCR技术概况 | 第29页 |
| ·hiTAIL-PCR技术概况 | 第29-30页 |
| 7 立题背景及主要研究内容 | 第30-32页 |
| ·立题背景 | 第30页 |
| ·主要研究内容 | 第30-31页 |
| ·技术路线 | 第31-32页 |
| 第二章 红曲霉Mr-5菌株T-DNA转化库的构建 | 第32-40页 |
| 1 材料与仪器 | 第32-34页 |
| ·菌株和质粒 | 第32-33页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第33页 |
| ·主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 2 实验方法 | 第34-35页 |
| ·Mr-5菌株对潮霉素的耐受检测 | 第34页 |
| ·根癌农杆菌介导的T-DNA转化 | 第34页 |
| ·红曲霉孢子悬浮液的制备 | 第34页 |
| ·根癌农杆菌的活化及诱导培养 | 第34页 |
| ·红曲霉孢子与根癌农杆菌的共培养 | 第34页 |
| ·转化子的筛选 | 第34页 |
| ·转化率影响因素 | 第34-35页 |
| ·根癌农杆菌浓度 | 第34-35页 |
| ·红曲霉培养时间 | 第35页 |
| ·红曲霉孢子液浓度 | 第35页 |
| ·乙酰丁香酮(AS)浓度 | 第35页 |
| ·共培养温度 | 第35页 |
| ·共培养时间 | 第35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-38页 |
| ·Mr-5菌株对潮霉素的耐受检测 | 第35-36页 |
| ·转化率影响因素 | 第36-38页 |
| ·根癌农杆菌浓度 | 第36页 |
| ·红曲霉培养时间 | 第36页 |
| ·红曲霉孢子液浓度 | 第36-37页 |
| ·乙酰丁香酮(AS)浓度 | 第37页 |
| ·共培养温度 | 第37页 |
| ·共培养时间 | 第37-38页 |
| ·优化后的高效转化体系和T-DNA标签库的构建 | 第38页 |
| 4 讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 红曲霉转化库的分析与形态观察 | 第40-49页 |
| 1 材料与仪器 | 第40-41页 |
| ·菌株 | 第40页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第40页 |
| ·主要仪器设备 | 第40-41页 |
| 2 实验方法 | 第41-42页 |
| ·转化子的遗传稳定性分析 | 第41页 |
| ·转化子的PCR鉴定 | 第41页 |
| ·转化子基因组的提取 | 第41页 |
| ·潮霉素基因的PCR扩增 | 第41页 |
| ·转化子的菌落及显微形态观察 | 第41-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-48页 |
| ·转化子的遗传稳定性 | 第42页 |
| ·转化子潮霉素抗性的PCR鉴定 | 第42页 |
| ·转化子的形态观察 | 第42-48页 |
| 4 讨论 | 第48-49页 |
| 第四章 产GABA相关转化子的筛选 | 第49-55页 |
| 1 材料与仪器 | 第49-50页 |
| ·菌株 | 第49页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第49页 |
| ·主要仪器设备 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-51页 |
| ·纸层析法测定GABA | 第50页 |
| ·GABA标准曲线 | 第50页 |
| ·转化子GABA产量测定 | 第50页 |
| ·高效液相法(HPLC)测定GABA | 第50-51页 |
| ·GABA标准曲线 | 第50页 |
| ·转化子GABA产量测定 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-53页 |
| ·纸层析法筛选GABA产量差异大的红曲霉转化子 | 第51-52页 |
| ·HPLC检测红曲霉转化子中GABA产量 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-55页 |
| 第五章 产桔霉素相关转化子的筛选 | 第55-63页 |
| 1 材料与仪器 | 第55-56页 |
| ·菌株 | 第55页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第55页 |
| ·主要仪器设备 | 第55-56页 |
| 2 实验方法 | 第56-57页 |
| ·薄层层析法(TLC)测定桔霉素 | 第56页 |
| ·桔霉素定性检测 | 第56页 |
| ·桔霉素定量检测 | 第56页 |
| ·高效液相法(HPLC)测定桔霉素 | 第56-57页 |
| ·桔霉素标准曲线绘制 | 第56页 |
| ·转化子桔霉素的精确定量 | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-61页 |
| ·TLC法筛选桔霉素产量差异大的红曲霉转化子 | 第57-58页 |
| ·HPLC法检测桔霉素产量差异大的红曲霉转化子 | 第58-59页 |
| ·经过两次筛选后获得的性状变化较大的转化子 | 第59-61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| 第六章 转化子T-DNA侧翼序列的TAIL-PCR扩增 | 第63-75页 |
| 1 材料与仪器 | 第63页 |
| ·菌株 | 第63页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第63页 |
| ·主要仪器设备 | 第63页 |
| 2 实验方法 | 第63-69页 |
| ·转化子T-DNA侧翼序列扩增 | 第63-68页 |
| ·转化子基因组DNA的提取 | 第63页 |
| ·TAIL-PCR和hiTAIL-PCR的引物设计 | 第63-65页 |
| ·TAIL-PCR和hiTAIL-PCR的反应体系 | 第65-67页 |
| ·扩增产物的检测与纯化 | 第67-68页 |
| ·扩增产物的测序 | 第68页 |
| ·PCR产物的TA连接 | 第68页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第68页 |
| ·质粒转化 | 第68页 |
| ·测序 | 第68页 |
| ·扩增产物的分析 | 第68-69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-73页 |
| ·TAIL-PCR和hiTAIL-PCR扩增 | 第69-71页 |
| ·扩增产物的测序及生物信息学分析 | 第71-73页 |
| 4 讨论 | 第73-75页 |
| 第七章 红曲霉产GABA相关基因的分析 | 第75-87页 |
| 1 材料与仪器 | 第75-76页 |
| ·菌株 | 第75页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第75页 |
| ·主要仪器设备 | 第75-76页 |
| 2 实验方法 | 第76-79页 |
| ·GAD序列的全长扩增 | 第76-78页 |
| ·红曲霉Mr-5的基因组提取 | 第76页 |
| ·红曲霉转化子660T-DNA侧翼序列与红曲霉GAD序列的比对分析 | 第76页 |
| ·红曲霉基因组中GAD基因全长的扩增 | 第76-78页 |
| ·GAD基因序列的分析 | 第78-79页 |
| ·红曲霉基因组中GAD序列及氨基酸序列分析 | 第78页 |
| ·红曲霉基因组中GAD序列保守结构域及活性位点分析 | 第78-79页 |
| ·多重氨基酸序列对比 | 第79页 |
| 3 结果分析 | 第79-86页 |
| ·红曲霉基因组GAD序列的全长扩增 | 第79-80页 |
| ·红曲霉基因组GAD序列的验证 | 第80-82页 |
| ·红曲霉基因组GAD序列的分析 | 第82-86页 |
| ·红曲霉基因组中GAD序列及氨基酸序列 | 第82页 |
| ·红曲霉基因组中GAD保守结构域及活性位点 | 第82-84页 |
| ·多重氨基酸序列对比 | 第84-86页 |
| 4 讨论 | 第86-87页 |
| 第八章 小结与建议 | 第87-89页 |
| 1 小结 | 第87-88页 |
| 2 建议 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-97页 |
| 附录 TAIL-PCR测序结果 | 第97-103页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第103-104页 |
| 致谢词 | 第104-105页 |
| 浙江师范大学学位论文诚信承诺书 | 第105-106页 |
