| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 符号说明 | 第9-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-27页 |
| 1 硫酸盐的吸收和转运 | 第16页 |
| 2 胞内硫酸盐同化作用机制 | 第16-17页 |
| 3 硫代谢相关酶及含硫化合物 | 第17-21页 |
| ·ATP硫酸化酶(ATP Sulfurylase,ATPS) | 第17-18页 |
| ·腺苷5’-磷酰硫酸激酶(APSK) | 第18页 |
| ·腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶(APSR) | 第18-19页 |
| ·谷胱甘肽(glutathione GSH) | 第19-20页 |
| ·芥子油苷 | 第20页 |
| ·3'-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS) | 第20-21页 |
| 4 硫同化作用的调控 | 第21-25页 |
| ·代谢水平的调控 | 第22-23页 |
| ·转录水平调控 | 第23页 |
| ·翻译与翻译后水平调控 | 第23-25页 |
| 本研究的目的及选题意义 | 第25-27页 |
| 第二部分 研究内容 | 第27-68页 |
| 第一章 氧化还原环境对水稻APSK蛋白催化活性的影响 | 第27-50页 |
| 1 前言 | 第27-28页 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 | 第28页 |
| ·酶与生化试剂 | 第28页 |
| ·菌株与载体 | 第28页 |
| 3 实验方法 | 第28-43页 |
| ·水稻RNA的提取 | 第28-30页 |
| ·逆转录合成cDNA | 第30页 |
| ·pHHAL-OsAPSK克隆载体的构建 | 第30-34页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测 | 第31页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第31-32页 |
| ·E.coli DH5a感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·PCR产物与T载体连接 | 第32-33页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态E.coli DH5α | 第33页 |
| ·PCR验证 | 第33页 |
| ·保存菌液与测序 | 第33页 |
| ·质粒提取 | 第33-34页 |
| ·双酶切载体(pHHAL)及质粒(pMD-18T-Simple-APSK) | 第34页 |
| ·割胶回收 | 第34-35页 |
| ·构建重组质粒pHHAL-APSK | 第35-36页 |
| ·蛋白表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第36页 |
| ·连接产物pHHAL-APSK转化表达菌株 | 第36页 |
| ·APSK蛋白诱导表达、纯化 | 第36-42页 |
| ·蛋白诱导表达 | 第36页 |
| ·水稻APSK蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| ·透析袋的预处理 | 第37页 |
| ·蛋白透析 | 第37-38页 |
| ·蛋白标签的去除 | 第38页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第38-39页 |
| ·试剂配制 | 第38-39页 |
| ·标准曲线的制作 | 第39页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第39页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 | 第39-40页 |
| ·水稻野生型APSK活性测定 | 第40-41页 |
| ·还原条件测蛋白活性 | 第40-41页 |
| ·氧化条件测定蛋白活性 | 第41页 |
| ·水稻APSK突变体表达载体的构建及活性测定 | 第41-42页 |
| ·确定突变位点及设计突变引物 | 第41页 |
| ·质粒提取 | 第41-42页 |
| ·突变PCR扩增 | 第42页 |
| ·电泳检测 | 第42页 |
| ·产物的处理与纯化 | 第42页 |
| ·转化与测序 | 第42页 |
| ·水稻APSK1突变蛋白的诱导表达、纯化及活性测定 | 第42-43页 |
| ·突变体蛋白的诱导表达与纯化 | 第42页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 | 第42页 |
| ·突变蛋白透析 | 第42-43页 |
| ·蛋白浓度的测定及蛋白浓缩 | 第43页 |
| ·水稻APSK1突变蛋白活性测定 | 第43页 |
| 4 实验结果 | 第43-47页 |
| ·不同物种APSK序列比对结果 | 第43-44页 |
| ·水稻APSK的基因克隆及突变 | 第44页 |
| ·水稻APSK1载体构建 | 第44-45页 |
| ·水稻APSK的蛋白表达与纯化 | 第45页 |
| ·水稻APSK的APS磷酸化活性分析 | 第45-47页 |
| ·水稻APSK突变体C36A/C69A的APS磷酸化活性测定 | 第47页 |
| ·水稻APSK蛋白野生型与突变体酶活参数 | 第47页 |
| 5 讨论 | 第47-50页 |
| 第二章 3’,5’-二磷酸核苷酸酶及突变蛋白对菌体生长的影响 | 第50-68页 |
| 1 前言 | 第50页 |
| 2 材料与方法 | 第50-51页 |
| ·菌株与载体 | 第50-51页 |
| ·酶与生化试剂 | 第51页 |
| 3 实验方法 | 第51-58页 |
| ·大肠杆菌3’,5’-二磷酸腺苷酸酶(CysQ)及突变蛋白的生化分析 | 第51-56页 |
| ·CysQ表达载体构建及蛋白表达纯化 | 第51-55页 |
| ·大肠杆菌基因组的提取 | 第51-52页 |
| ·引物的设计 | 第52页 |
| ·PCR扩增条件 | 第52-53页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测 | 第53页 |
| ·PCR产物纯化 | 第53页 |
| ·PCR产物连接pMD-18T-simple克隆载体 | 第53页 |
| ·目的基因连接克隆载体 | 第53页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备 | 第53页 |
| ·转化连接产物 | 第53页 |
| ·PCR验证及菌种送测 | 第53页 |
| ·载体及重组质粒双酶切 | 第53-54页 |
| ·转化构建表达载体 | 第54页 |
| ·转化构建表达载体 | 第54页 |
| ·蛋白的诱导 | 第54页 |
| ·蛋白的诱导表达及纯化 | 第54-55页 |
| ·CysQ突变蛋白V152G的诱导表达及纯化 | 第55页 |
| ·确定突变位点并设计突变引物 | 第55页 |
| ·突变PCR扩增条件 | 第55页 |
| ·突变PCR产物纯化 | 第55页 |
| ·突变PCR产物转化 | 第55页 |
| ·菌液PCR验证及测序 | 第55页 |
| ·蛋白诱导表达及纯化 | 第55页 |
| ·CysQ及突变蛋白V152G体外酶学分析 | 第55-56页 |
| ·CysQ及突变体菌体生长曲线测定 | 第56页 |
| ·M9培养基的配制 | 第56页 |
| ·CysQ及突变体菌体浓度测定 | 第56页 |
| ·酵母3’,5'-二核苷酸酶(HAL2)及突变体蛋白对菌体生长影响分析 | 第56-58页 |
| ·菌体活化 | 第56页 |
| ·M9培养基的配置 | 第56-57页 |
| ·菌体缺硫培养 | 第57页 |
| ·不同丙酮酸浓度测菌体生长曲线 | 第57-58页 |
| ·不同浓度1,6-二磷酸果糖对HAL2及同源蛋白体外抑制活性测定 | 第58页 |
| 4 实验结果 | 第58-66页 |
| ·引物设计 | 第58页 |
| ·电泳检测PCR产物 | 第58-59页 |
| ·大肠杆菌CysQ基因的菌液PCR电泳图像 | 第58-59页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测蛋白表达 | 第59-61页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测CysQ及突变蛋白表达 | 第59-61页 |
| ·HAL2及突变体G236V菌体生长曲线 | 第61-63页 |
| ·M9培养基培养测HAL2及突变体G236V菌体的生长曲线 | 第61-62页 |
| ·不同浓度的丙酮酸测HAL2及G236V菌株生长曲线 | 第62-63页 |
| ·1,6-二磷酸果糖(FBP)对HAL2与G236V蛋白抑制活性分析 | 第63页 |
| ·CysQ及突变体对细菌生长的影响 | 第63-64页 |
| ·FBP对CysQ与V152G蛋白抑制活性分析 | 第64-65页 |
| ·CysQ及突变体V152G酶活测定 | 第65-66页 |
| 5 讨论 | 第66-68页 |
| 结论与展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 浙江师范大学学位论文诚信承诺书 | 第79-80页 |
