| 中文摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 中文文摘 | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 绪论 | 第14-28页 |
| 1 群体感应概述 | 第14页 |
| 2 群体感应的类型 | 第14-16页 |
| ·以AHL为信号分子的革兰氏阴性细菌中的群体感应系统 | 第14-15页 |
| ·以AIP为信号分子的革兰氏阳性细菌中的群体感应系统 | 第15-16页 |
| ·以AI-2为信号分子的种间群体感应系统 | 第16页 |
| 3 细菌群体感应的抑制 | 第16-17页 |
| ·利用信号分子的结构类似物,竞争性接合受体分子 | 第17页 |
| ·利用酶降解信号分子,降低信号分子浓度 | 第17页 |
| 4 群体感应淬灭剂-AiiA蛋白 | 第17-20页 |
| ·aiiA基因简介 | 第17-18页 |
| ·AiiA蛋白的结构、作用机理及活性检测方法 | 第18-19页 |
| ·AiiA蛋白应用于群体感应淬灭的研究进展 | 第19-20页 |
| 5 毕赤酵母表达系统 | 第20-25页 |
| ·毕赤酵母表达系统表达菌株 | 第20-22页 |
| ·毕赤酵母表达系统表达载体 | 第22-23页 |
| ·PAOX型表达载体 | 第22-23页 |
| ·PGAP型表达载体 | 第23页 |
| ·外源基因在毕赤酵母表达系统中表达的影响因素 | 第23-25页 |
| ·外源基因自身的影响 | 第23-24页 |
| ·发酵条件的影响 | 第24-25页 |
| ·毕赤酵母表达系统优点 | 第25页 |
| 6 本课题的研究目的及意义 | 第25-28页 |
| 第一章 aiiA基因真核表达载体的构建 | 第28-40页 |
| 第一节 前言 | 第28页 |
| 第二节 材料与方法 | 第28-35页 |
| ·实验材料 | 第28-29页 |
| ·实验菌株与载体 | 第28-29页 |
| ·主要酶和试剂 | 第29页 |
| ·主要培养基及试剂配制 | 第29页 |
| ·仪器与设备 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-35页 |
| ·引物的设计与合成 | 第29-30页 |
| ·苏云金芽孢杆菌质粒DNA的提取 | 第30-31页 |
| ·aiiA基因的扩增 | 第31页 |
| ·琼脂糖电泳鉴定PCR产物 | 第31-32页 |
| ·PCR产物的回收 | 第32页 |
| ·重组克隆载体pMD18-T-aiiA的构建 | 第32-33页 |
| ·重组克隆载体pMD18-T-aiiA的验证 | 第33-34页 |
| ·重组表达载体pPICZA-aiiA、pPICZαB-aiiA的构建 | 第34-35页 |
| 第三节 结果与分析 | 第35-39页 |
| ·aiiA基因的扩增 | 第35页 |
| ·重组克隆载体pMD18-T-aiiA的鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组表达载体pPICZA-aiiA、pPICZaB-aiiA的鉴定 | 第36-39页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第39-40页 |
| 第二章 工程菌GS115-pPICZA-aiiA的构建及表达 | 第40-56页 |
| 第一节 前言 | 第40页 |
| 第二节 材料与方法 | 第40-48页 |
| ·实验材料 | 第40-42页 |
| ·菌种与质粒 | 第40页 |
| ·主要试剂及配制 | 第40-42页 |
| ·仪器与设备 | 第42页 |
| ·实验方法 | 第42-48页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第42-43页 |
| ·重组转化子表型筛选 | 第43页 |
| ·重组转化子的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| ·工程菌GS115-pPICZA-aiiA的诱导表达及鉴定 | 第44-45页 |
| ·表达产物的纯化 | 第45-46页 |
| ·考马斯亮蓝G250法测定蛋白质浓度 | 第46页 |
| ·UPLC法测定AiiA蛋白酶活力 | 第46-47页 |
| ·表达产物纯化液的Western Blotting鉴定 | 第47-48页 |
| ·表达产物对胡萝卜软腐欧文氏杆菌的抗病性分析 | 第48页 |
| 第三节 结果与分析 | 第48-54页 |
| ·毕赤酵母重组工程菌GS115/pPICZA-aiiA的鉴定 | 第48-49页 |
| ·GS115/pPICZA-aiiA的表达 | 第49-50页 |
| ·GS115/pPICZA-aiiA表达产物的纯化 | 第50-51页 |
| ·GS115/pPICZA-aiiA表达产物的Western blotting鉴定 | 第51-52页 |
| ·GS115/pPICZA-aiiA表达产物的抗病性鉴定 | 第52页 |
| ·牛血清蛋白标准曲线的制备 | 第52-53页 |
| ·高丝氨酸内酯(AHL)标准曲线的绘制 | 第53页 |
| ·AiiA蛋白酶活力的测定 | 第53-54页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 第三章 工程菌GS115-pPICZαB-aiiA的构建及表达 | 第56-66页 |
| 第一节 前言 | 第56页 |
| 第二节 材料与方法 | 第56-59页 |
| ·实验材料 | 第56-57页 |
| ·菌种与质粒 | 第56页 |
| ·主要试剂 | 第56页 |
| ·主要培养基及缓冲液 | 第56-57页 |
| ·仪器与设备 | 第57页 |
| ·实验方法 | 第57-59页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第57-58页 |
| ·重组转化子GS115-pPICZαB-aiiA的PCR鉴定 | 第58页 |
| ·工程菌GS115-pPICZαB-aiiA的诱导表达 | 第58页 |
| ·发酵上清液的处理 | 第58-59页 |
| ·发酵上清液蛋白的纯化 | 第59页 |
| ·SDS-PAGE电泳鉴定、Western Blotting鉴定 | 第59页 |
| ·考马斯亮蓝G250法测定蛋白质浓度 | 第59页 |
| ·表达产物酶活力测定、抗病性分析 | 第59页 |
| 第三节 结果与分析 | 第59-64页 |
| ·重组工程菌GS115-pPICZαB-aiiA的鉴定 | 第59-60页 |
| ·GS115-pPICZαB-aiiA的诱导表达 | 第60-62页 |
| ·GS115-pPICZαB-aiiA表达产物的Western blotting鉴定 | 第62页 |
| ·GS115-pPICZαB-aiiA表达产物的活性检测 | 第62-63页 |
| ·表达产物酶活力的测定 | 第63-64页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第64-66页 |
| 第四章 苏云金芽孢杆菌aiiA基因密码子优化及其表达 | 第66-84页 |
| 第一节 前言 | 第66页 |
| 第二节 材料方法 | 第66-70页 |
| ·实验材料 | 第66-67页 |
| ·菌株及质粒 | 第67页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·主要培养基及缓冲液 | 第67页 |
| ·方法 | 第67-70页 |
| ·突变位点的选择及定点突变引物的设计 | 第67-68页 |
| ·质粒的提取 | 第68页 |
| ·定点突变PCR条件的摸索 | 第68页 |
| ·突变质粒的筛选 | 第68页 |
| ·大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备、热击转化 | 第68页 |
| ·菌液PCR、质粒PCR及酶切鉴定 | 第68-69页 |
| ·突变质粒测序鉴定 | 第69页 |
| ·突变质粒的线性化 | 第69页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及突变质粒转化毕赤酵母 | 第69页 |
| ·毕赤酵母工程菌GS115-pPICZαB-MaiiA的诱导表达 | 第69-70页 |
| ·毕赤酵母工程菌GS115-pPICZαB-MaiiA诱导表达产物的纯化 | 第70页 |
| ·诱导表达产物的Western Blotting鉴定及抗病活性分析 | 第70页 |
| 第三节 结果与分析 | 第70-81页 |
| ·定点突变78-81-84位点PCR鉴定 | 第70-71页 |
| ·突变78-81-84位点质粒的酶切鉴定 | 第71-72页 |
| ·aiiA突变基因的测序及分析 | 第72-73页 |
| ·定点突变373-378位点PCR结果 | 第73-74页 |
| ·突变373-378位点质粒的转化及菌液PCR、质粒PCR | 第74-75页 |
| ·突变373-378位点质粒的酶切鉴定 | 第75-76页 |
| ·aiiA突变基因的测序及分析 | 第76-77页 |
| ·突变质粒的线性化 | 第77页 |
| ·重组酵母菌株GS115/pPICZαB-MaiiA的鉴定 | 第77-79页 |
| ·GS115/pPICZαB-MaiiA的诱导表达及其表达产物的检测 | 第79-80页 |
| ·表达产物抗病性实验分析 | 第80-81页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第81-84页 |
| 第五章 结论 | 第84-86页 |
| 展望 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-96页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第96-98页 |
| 致谢 | 第98-100页 |
| 个人简历 | 第100-102页 |
