| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 名词缩写 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-21页 |
| 1 灵芝研究进展 | 第13-16页 |
| ·灵芝的化学成分和生物学活性 | 第13-15页 |
| ·灵芝分子生物学研究 | 第15-16页 |
| 2 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的研究进展 | 第16-19页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶在甲羟戊酸途径中的位置 | 第17页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的催化反应机理 | 第17-18页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的生化性质与结构 | 第18页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆 | 第18-19页 |
| ·关于MVD抑制剂的研究 | 第19页 |
| 3 本文选题依据 | 第19-21页 |
| 第二章 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆、分析及功能验证 | 第21-47页 |
| 第一节 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因特异片段的克隆 | 第22-27页 |
| 1 实验材料 | 第22页 |
| ·菌株和质粒 | 第22页 |
| ·菌株培养 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| ·培养基与缓冲液 | 第22页 |
| 2 实验方法 | 第22-25页 |
| ·灵芝基因组DNA的提取(CTAB法) | 第22-23页 |
| ·序列比较和简并引物的设计 | 第23-24页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因特异片段的PCR扩增 | 第24页 |
| ·扩增片段的回收与克隆 | 第24-25页 |
| 3 结果与讨论 | 第25-27页 |
| 第二节 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的获得、分析及启动子区的获得 | 第27-41页 |
| 1 实验材料 | 第27页 |
| ·菌株和质粒 | 第27页 |
| ·菌株培养 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27页 |
| 2 实验方法 | 第27-34页 |
| ·灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因基因组DNA5’端及启动子区的获得 | 第27-29页 |
| ·灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因cDNA 3’端和3’UTR的获得 | 第29-32页 |
| ·灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因基因组及cDNA全长的获得 | 第32-34页 |
| 3 结果与讨论 | 第34-41页 |
| ·灵芝MVD基因组DNA 5’端及启动子区的获得 | 第34页 |
| ·灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因cDNA 3’端序列的获得 | 第34-36页 |
| ·灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因基因组DNA及cDNA全长的获得 | 第36页 |
| ·基因组序列和cDNA序列旳比较 | 第36-39页 |
| ·灵芝甲经戊酸焦碟酸脱接酶基因的序列分析 | 第39页 |
| ·系统发育树构建 | 第39页 |
| ·结构域预测 | 第39-41页 |
| 第三节 灵芝甲轻戊酸焦磷酸脱矮酶基因的功能验证 | 第41-47页 |
| 1 实验材料 | 第41页 |
| ·菌株与质粒 | 第41页 |
| ·试剂 | 第41页 |
| 2 实验方法 | 第41-44页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第41-43页 |
| ·酵母感受态细胞的制备和质粒转化 | 第43-44页 |
| ·缺陷型单倍体的筛选及灵芝MVD基因的功能验证 | 第44页 |
| 3 结果与讨论 | 第44-47页 |
| ·重组质粒酶切验证 | 第44-45页 |
| ·功能互补 | 第45-47页 |
| 第三章 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因表达特性分析及超量表达研究 | 第47-65页 |
| 第一节 灵芝甲羟戊酸焦磷酸基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 | 第48-53页 |
| 1 实验材料 | 第48页 |
| 2 试验方法 | 第48-52页 |
| ·表达载体的构建策略 | 第48-50页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶蛋白的诱导表达 | 第50页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第50-51页 |
| ·甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶蛋白纯化 | 第51-52页 |
| ·多克隆抗体的制备及纯化 | 第52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-53页 |
| 第二节 灵芝甲羟戊酸焦磷酸基因基因表达特性研究 | 第53-60页 |
| 1 实验材料 | 第53页 |
| ·试剂 | 第53页 |
| ·菌丝培养 | 第53页 |
| 2 实验方法 | 第53-56页 |
| ·RNA的提取 | 第53页 |
| ·cDNA的获得 | 第53-54页 |
| ·Real-time PCR | 第54页 |
| ·菌丝和原基粗蛋白的提取 | 第54-55页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜 | 第55页 |
| ·Western Blot | 第55-56页 |
| 3 结果与讨论 | 第56-60页 |
| ·MVD基因在灵芝不同发育时期的表达谱分析 | 第56-57页 |
| ·MVD基因在不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)处理下的表达谱分析 | 第57-60页 |
| 第三节 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的超量表达研究 | 第60-65页 |
| 1 实验材料 | 第60页 |
| 2 实验方法 | 第60-63页 |
| ·超量表达载体的构建 | 第60-62页 |
| ·电击转化步骤 | 第62-63页 |
| 3 结果与讨论 | 第63-65页 |
| 第四章 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因启动子活性分析 | 第65-75页 |
| 1 实验材料 | 第65页 |
| 2 实验方法 | 第65-70页 |
| ·灵芝甲轻戊酸焦碟酸脱接酶基因的启动子分析 | 第65页 |
| ·报告载体的构建 | 第65-67页 |
| ·灵芝原生质体制备 | 第67-68页 |
| ·农杆菌感受态制备 | 第68-69页 |
| ·质粒转化农杆菌 | 第69页 |
| ·农杆菌介导的原生质体转化 | 第69页 |
| ·GUS酶活力的荧光测定 | 第69-70页 |
| 3 结果与讨论 | 第70-75页 |
| ·灵芝甲经戊酸焦碟酸脱接酶基因旳启动子分析 | 第70-72页 |
| ·启动子基本活性分析 | 第72-73页 |
| ·启动子缺失分析 | 第73-75页 |
| 全文总结 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-85页 |
| 附录一 | 第85-89页 |
| 附录二 | 第89-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
