| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| P11 研究进展 | 第11-15页 |
| 第一部分 P11 蛋白的高效表达、纯化以及溶栓功能的研究 | 第15-41页 |
| 前言 | 第15-16页 |
| 第1章 P11 蛋白的克隆、表达及纯化 | 第16页 |
| 1 实验材料和方法 | 第16-25页 |
| ·试验材料 | 第16-18页 |
| ·菌种与质粒 | 第16页 |
| ·试剂与仪器 | 第16-17页 |
| ·主要试剂和缓冲液 | 第17-18页 |
| ·其他 | 第18页 |
| ·P11 基因钓取 | 第18-19页 |
| ·pBV/P11 原核表达载体的构建 | 第19-22页 |
| ·P11cDNA片段和pBV220质粒的双酶切 | 第19-21页 |
| ·P11cDNA酶切片段与pBV220酶切载体的连接 | 第21页 |
| ·感受态细胞的制备—CaCl2法 | 第21页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第21-22页 |
| ·pBV/P11重组质粒的双酶切鉴定 | 第22页 |
| ·pBV/P11重组质粒测序鉴定 | 第22页 |
| ·P11蛋白的表达及优化 | 第22-25页 |
| ·pBV/P11质粒在大肠杆菌BL21宿主菌中的表达 | 第22-24页 |
| ·P11蛋白表达优化 | 第24-25页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第25页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第25页 |
| 2 实验结果 | 第25-29页 |
| ·P11基因钓取 | 第25-26页 |
| ·P11基因钓取pBV/P11表达载体的构建 | 第26页 |
| ·P11蛋白的表达 | 第26-28页 |
| ·P11蛋白表达电泳结果 | 第26-27页 |
| ·P11蛋白最佳宿主菌电泳结果 | 第27-28页 |
| ·P11蛋白表达的不同诱导时间的选择 | 第28页 |
| ·P11蛋白的纯化 | 第28-29页 |
| 3 结论与讨论 | 第29页 |
| 4 小结 | 第29-30页 |
| 第2章 重组P11蛋白功能的研究 | 第30页 |
| 1 P11蛋白浓度测定 | 第30-32页 |
| ·纯化蛋白的浓缩 | 第30页 |
| ·透析袋的处理 | 第30页 |
| ·P11蛋白的透析与浓缩 | 第30页 |
| ·P11蛋白浓度测定—Lowry法 | 第30-32页 |
| ·溶液配制 | 第30-31页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第31-32页 |
| 2 P11 生物功能的研究 | 第32-35页 |
| ·纤维蛋白平板法测定P11蛋白活性 | 第32-33页 |
| ·P11蛋白与葡激酶溶栓活性协同效应 | 第33页 |
| ·P11蛋白活性MTT法测定 | 第33-35页 |
| ·溶液配制 | 第34页 |
| ·细胞培养 | 第34页 |
| ·MTT法测定P11蛋白活性 | 第34-35页 |
| 3 结果与讨论 | 第35-38页 |
| ·P11蛋白溶栓活性测定结果 | 第35-37页 |
| ·重组蛋白P11溶栓活性测定 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白P11与葡激酶(SAK)在溶栓活性的协同效应 | 第36-37页 |
| ·P11蛋白活性MTT法测定结果 | 第37-38页 |
| 4 讨论 | 第38-41页 |
| 第二部分 P11与水蛭素融合基因的构建、表达及活性测定 | 第41-57页 |
| 1 实验材料和方法 | 第41页 |
| ·试验材料 | 第41-42页 |
| ·菌种与质粒 | 第41页 |
| ·试剂与仪器 | 第41-42页 |
| ·其他 | 第42页 |
| ·P11水蛭素融合蛋白基因获取 | 第42-44页 |
| ·P11基因的获取 | 第42页 |
| ·P11N端与水蛭素C肽融合的基因获取 | 第42-43页 |
| ·P11C端与水蛭素C肽融合的基因获取 | 第43-44页 |
| ·pBV/HVP原核表达载体的构建 | 第44-46页 |
| ·HVPcDNA片段和pBV220质粒的双酶切 | 第44-45页 |
| ·HVPcDNA酶切片段与pBV220酶切载体的连接 | 第45页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第45页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第45页 |
| ·pBV/HVP重组质粒的双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·pBV/P11重组质粒测序鉴定 | 第46页 |
| ·pBV/PCHV原核表达载体的构建 | 第46页 |
| ·HVP重组蛋白在宿主菌中的表达 | 第46-47页 |
| ·将pBV/HVP质粒转化到BL21感受态细胞中 | 第46页 |
| ·pBV/HVP在大肠杆菌BL21宿主菌中的表达 | 第46-47页 |
| ·PCHV重组蛋白在宿主菌中的表达 | 第47页 |
| ·HVP重组蛋白的纯化 | 第47页 |
| ·PCHV重组蛋白的纯化 | 第47-48页 |
| ·HVP及PCHV重组蛋白的生物学活性测定 | 第48页 |
| ·Bradford法测定重组蛋白含量 | 第48页 |
| ·重组蛋白溶栓活性测定 | 第48页 |
| ·重组蛋白抗凝活性测定 | 第48页 |
| 2 结果 | 第48页 |
| ·P11水蛭素融合基因的获取 | 第48-49页 |
| ·P11N端与水蛭素C肽融合基因的获得 | 第48-49页 |
| ·P11C端与水蛭素C肽融合基因的获得 | 第49页 |
| ·pBV/HVP、pBV/PCHV表达载体的构建 | 第49-51页 |
| ·HVP融合蛋白及PCHV融合蛋白的表达 | 第51页 |
| ·HVP融合蛋白及PCHV融合蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| ·HVP及PCHV融合蛋白溶栓活性检测 | 第52-53页 |
| ·HVP及PCHV融合蛋白抗凝活性检测 | 第53-54页 |
| ·P11、PCHV、HVP融合蛋白活性比较 | 第54页 |
| ·结论 | 第54页 |
| 3 讨论 | 第54-57页 |
| 参考文献 | 第57-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
