| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-14页 |
| 1 绪论 | 第14-30页 |
| ·引言 | 第14-16页 |
| ·研究背景 | 第16-24页 |
| ·昆虫病原真菌防治害虫简史 | 第16-18页 |
| ·病原真菌侵染寄主昆虫的过程 | 第18页 |
| ·虫生真菌侵染致病机理 | 第18-23页 |
| ·寄主的抵御作用 | 第23-24页 |
| ·立题依据 | 第24-26页 |
| ·主要研究内容 | 第26-27页 |
| ·整体设计思路 | 第27页 |
| ·创新之处 | 第27-30页 |
| 2 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因(ATM1)的克隆及分析 | 第30-54页 |
| ·技术路线 | 第30页 |
| ·材料与方法 | 第30-39页 |
| ·主要仪器设备 | 第30-31页 |
| ·主要试剂 | 第31页 |
| ·培养基及部分储液配方 | 第31-32页 |
| ·试验菌株与质粒 | 第32页 |
| ·供试菌株培养及分生孢子悬浮液制备 | 第32页 |
| ·金龟子绿僵菌 CQMa102 DNA 的提取 | 第32-33页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 mRNA 的提取 | 第33页 |
| ·3’RACE 法克隆 ATM1 基因3’端cDNA 序列 | 第33-35页 |
| ·SMART 5'-RACE 法克隆 ATM1 基因5’端cDNA 序列 | 第35-37页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 ATM1 基因的PCR 扩增和克隆 | 第37-38页 |
| ·ATM1 基因的 Southern 杂交验证 | 第38-39页 |
| ·结果与分析 | 第39-53页 |
| ·ATM1 基因3’端cDNA 序列克隆 | 第39-40页 |
| ·ATM1 基因5’端cDNA 序列克隆 | 第40-41页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 ATM1 基因DNA 和cDNA 的PCR 扩增 | 第41-42页 |
| ·ATM1 基因序列分析 | 第42-46页 |
| ·ATM1 基因氨基酸序列分析 | 第46-51页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 ATM1 基因的Southern 杂交分析 | 第51-53页 |
| ·讨论 | 第53-54页 |
| 3 绿僵菌酸性海藻糖酶在重组毕赤酵母菌株中的诱导表达、纯化及特性分析 | 第54-85页 |
| ·技术路线 | 第54-55页 |
| ·材料与方法 | 第55-67页 |
| ·实验菌株与质粒 | 第55-56页 |
| ·主要仪器设备 | 第56页 |
| ·主要化学试剂 | 第56页 |
| ·培养基及部分储液配方 | 第56-59页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K-ATM1 的构建 | 第59-60页 |
| ·电激法转化巴斯德毕赤酵母菌株KM71 | 第60-61页 |
| ·高表达ATM1 的重组表达毕赤酵母菌株的筛选 | 第61-63页 |
| ·ReATM1p 纯化的方法步骤 | 第63-64页 |
| ·ATM1 表达产物的检测 | 第64-65页 |
| ·酸性海藻糖酶(ReATM1p)的性质测定 | 第65-67页 |
| ·结果与分析 | 第67-77页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K/ATM1 的构建 | 第67-68页 |
| ·P. pastoris/ pPIC9K-ATM1 工程菌株的构建与筛选 | 第68-69页 |
| ·酸性海藻糖酶的分离纯化 | 第69-71页 |
| ·酸性海藻糖酶去糖基化 | 第71-72页 |
| ·酸性海藻糖酶蛋白的酶学特性 | 第72-77页 |
| ·讨论 | 第77-85页 |
| ·P. pastoris 表达系统的特点及其对 ATM1 表达的影响 | 第77-80页 |
| ·毕赤酵母系统表达的ATM1 的糖基化修饰 | 第80-81页 |
| ·影响ATM1 在P. pastoris 中表达的因素 | 第81-82页 |
| ·reATM1p 的纯化及纯化过程中存在的问题 | 第82页 |
| ·酸性海藻糖酶(reATM1p)酶学特性分析 | 第82-85页 |
| 4 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因(ATM1)的RNAI | 第85-111页 |
| ·技术路线 | 第85-86页 |
| ·材料与方法 | 第86-95页 |
| ·试验菌株与质粒 | 第86页 |
| ·主要仪器设备 | 第86页 |
| ·主要试剂和培养基 | 第86-88页 |
| ·金龟子绿僵菌ATM1 的RNA 干扰载体的构建 | 第88-90页 |
| ·RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌分生孢子 | 第90-91页 |
| ·RNA 干扰转化子的筛选 | 第91-92页 |
| ·RNA 干扰载体转化子的 Southern 杂交验证 | 第92页 |
| ·CQMa102 海藻糖降解酶同工酶分析 | 第92-93页 |
| ·转化菌株和出发菌株酸性海藻糖酶活性测定 | 第93-94页 |
| ·荧光定量PCR 测定转化菌株和出发菌株ATM1 基因的mRNA 表达量 | 第94-95页 |
| ·结果与分析 | 第95-106页 |
| ·RNA 干扰载体的构建和鉴定 | 第95-98页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 分生孢子对苯莱特的抗性实验 | 第98-99页 |
| ·ATM1 RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌 CQMa102 分生孢子的筛选结果 | 第99-103页 |
| ·RNA 干扰转化子的 Southern blot 鉴定 | 第103页 |
| ·不同碳源对绿僵菌海藻糖降解酶同工酶的影响 | 第103-104页 |
| ·转化菌株RA14、RA42、RA74 和出发菌株酸性海藻糖酶的测定 | 第104-105页 |
| ·荧光定量RT-PCR 方法检测转化菌株RA14、RA42、RA74 和出发菌株ATM1的mRNA 水平 | 第105-106页 |
| ·讨论 | 第106-111页 |
| ·siRNA 的制备 | 第106-107页 |
| ·ATM1 的 RNA 干扰作用的分析 | 第107-111页 |
| 5 结论及展望 | 第111-113页 |
| 致谢 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-125页 |
| 附录 | 第125-126页 |
