| 中文摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-44页 |
| 1. 引言 | 第14页 |
| 2. 超氧化物歧化酶的研究进展 | 第14-34页 |
| ·SOD 的分布与类型 | 第14-17页 |
| ·SOD 的结构和性质 | 第17-25页 |
| ·SOD 的结构 | 第17-23页 |
| ·SOD 的一级结构 | 第17-19页 |
| ·SOD 的高级结构 | 第19-23页 |
| ·SOD 的理化性质 | 第23-25页 |
| ·SOD 是亲水性的蛋白质 | 第23-24页 |
| ·SOD 的紫外吸收 | 第24页 |
| ·金属辅基与酶活性 | 第24页 |
| ·SOD 的还原和失活作用 | 第24页 |
| ·SOD 的免疫原性 | 第24-25页 |
| ·电离辐射对SOD 的影响 | 第25页 |
| ·磁场对SOD 的影响 | 第25页 |
| ·SOD 的分子生物学 | 第25-32页 |
| ·SOD 编码的基因 | 第25-27页 |
| ·SOD 的基因克隆和表达 | 第27-30页 |
| ·SOD 的基因表达调控 | 第30-32页 |
| ·SOD 的应用 | 第32-34页 |
| ·SOD 在临床及工业上的应用 | 第32-34页 |
| ·SOD 在农业领域的应用 | 第34页 |
| 3. 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第34-41页 |
| ·基因表达系统概述 | 第34-36页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的特性 | 第36-37页 |
| ·毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型 | 第37-39页 |
| ·表达载体在毕赤酵母中的整合 | 第39-41页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程 | 第41页 |
| 4. 本研究的立题依据、研究内容和技术路线 | 第41-44页 |
| ·立题依据 | 第41-42页 |
| ·研究内容 | 第42-43页 |
| ·技术路线 | 第43-44页 |
| 第二章 嗜热毛壳菌（CHAETOMIUM THERMOPHILUM）超氧化物歧化酶的分离纯化及特性研究 | 第44-68页 |
| 1. 材料和方法 | 第45-54页 |
| ·实验材料 | 第45-46页 |
| ·供试菌株 | 第45页 |
| ·培养基 | 第45页 |
| ·固体PDA 培养基（马铃薯琼脂培养基） | 第45页 |
| ·液体Casein 培养基 | 第45页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第45-46页 |
| ·仪器设备 | 第45页 |
| ·试剂 | 第45-46页 |
| ·实验方法 | 第46-54页 |
| ·液体发酵培养 | 第46页 |
| ·不同培养时间对超氧化物歧化酶产生的影响 | 第46页 |
| ·酶活性测定 | 第46页 |
| ·测定方法 | 第46页 |
| ·酶的活力单位(U) | 第46页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第46-47页 |
| ·超氧化物歧化酶的分离纯化 | 第47-48页 |
| ·粗酶液的制备 | 第47页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第47页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第47页 |
| ·Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 | 第47-48页 |
| ·纯度鉴定 | 第48-50页 |
| ·电泳操作步骤 | 第48页 |
| ·溶液的配制 | 第48-50页 |
| ·分子量的测定 | 第50-51页 |
| ·SDS-PAGE 测定蛋白质分子量 | 第50-51页 |
| ·凝胶过滤层析测定蛋白质分子量 | 第51页 |
| ·SOD 的非变性电泳（PAGE）及电泳的活性染色 | 第51-53页 |
| ·SOD 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） | 第51页 |
| ·SOD 的活性染色 | 第51-52页 |
| ·凝胶的配制 | 第52-53页 |
| ·超氧化物歧化酶性质的研究 | 第53-54页 |
| ·SOD 的反应最适温度 | 第53页 |
| ·SOD 的反应最适pH 值 | 第53-54页 |
| ·SOD 的热稳定性 | 第54页 |
| ·SOD 的pH 值稳定性 | 第54页 |
| ·N-端氨基酸序列分析 | 第54页 |
| ·SOD 种类的测定 | 第54页 |
| 2. 结果与分析 | 第54-62页 |
| ·不同培养时间对产生超氧化物歧化酶的影响 | 第54-55页 |
| ·C. thermophilum 超氧化物歧化酶的分离纯化及鉴定 | 第55-57页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第55-56页 |
| ·Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 | 第56-57页 |
| ·超氧化物歧化酶纯化过程总表 | 第57页 |
| ·超氧化物歧化酶的一般性质 | 第57-61页 |
| ·SOD 的分子量 | 第57-58页 |
| ·SOD 的最适反应温度 | 第58-59页 |
| ·SOD 的最适反应pH 值 | 第59-60页 |
| ·SOD 的热稳定性 | 第60页 |
| ·SOD 的pH 值稳定性 | 第60-61页 |
| ·N-端氨基酸序列测定 | 第61-62页 |
| ·SOD 种类的测定 | 第62页 |
| 3. 讨论 | 第62-68页 |
| ·研究结果 | 第63-65页 |
| ·研究方法 | 第65-67页 |
| ·今后还应开展的工作 | 第67-68页 |
| 第三章 嗜热真菌超氧化物歧化酶的基因克隆及其序列分析 | 第68-115页 |
| 1. 材料和方法 | 第69-87页 |
| ·材料 | 第69-70页 |
| ·供试菌株 | 第69页 |
| ·菌株与质粒 | 第69页 |
| ·酶和生化试剂 | 第69页 |
| ·仪器 | 第69页 |
| ·培养基 | 第69页 |
| ·溶液配制 | 第69-70页 |
| ·嗜热真菌Mn-SOD 基因的cDNA 克隆 | 第70-83页 |
| ·引物设计 | 第70-72页 |
| ·总RNA 的提取( Trizol 法) | 第72-73页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第73页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第73-74页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的分离 | 第74-78页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的扩增 | 第74页 |
| ·PCR 产物回收 | 第74-75页 |
| ·与载体连接 | 第75页 |
| ·E.coli 感受态细胞的制备和转化 | 第75-77页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第77-78页 |
| ·序列测定 | 第78页 |
| ·目的基因3’末端的分离 | 第78-79页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD 基因3’末端的分离 | 第78-79页 |
| ·嗜热毛壳菌Mn-SOD 基因3’末端的分离 | 第79页 |
| ·目的基因5’末端的分离 | 第79-83页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第79-80页 |
| ·cDNA 第一链的纯化 | 第80页 |
| ·cDNA 第一链的加尾 | 第80-81页 |
| ·RACE-PCR 扩增 | 第81-82页 |
| ·二次PCR（巢式PCR） | 第82-83页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第83页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第83页 |
| ·嗜热毛壳菌CuZn-SOD 基因的cDNA 和Genomic DNA 的克隆及序列分析 | 第83-87页 |
| ·引物设计 | 第83-85页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的扩增 | 第85页 |
| ·目的基因3’末端的分离 | 第85页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第85页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第85页 |
| ·嗜热毛壳菌CuZn-SOD Genomic DNA 的克隆及序列分析 | 第85-87页 |
| ·菌丝体DNA 的抽提 | 第85-86页 |
| ·嗜热毛壳菌Genomic DNA PCR 扩增 | 第86页 |
| ·CuZn-SOD 的DNA 序列分析 | 第86-87页 |
| 2 结果与分析 | 第87-111页 |
| ·C. thermophilum 和T. lanuginosus 总RNA 的提取 | 第87-88页 |
| ·嗜热真菌Mn-SOD 基因的分离 | 第88-98页 |
| ·Mn-SOD 基因中间片段的分离 | 第88-89页 |
| ·T. lanuginosus Mn-SOD 基因cDNA 3’-末端的分离及序列分析 | 第89-92页 |
| ·C. thermophilum Mn-SOD 基因cDNA 3’-末端的分离 | 第92-93页 |
| ·C. thermophilum Mn-SOD 基因cDNA 5’-末端的分离 | 第93-94页 |
| ·C. thermophilum Mn-SOD 基因全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接 | 第94页 |
| ·C. thermophilum Mn-SOD 基因的核苷酸和氨基酸序列分析 | 第94-98页 |
| ·Mn-SOD 基因的核苷酸序列分析 | 第96-97页 |
| ·Mn-SOD 基因的氨基酸序列分析 | 第97-98页 |
| ·嗜热毛壳菌CuZn-SOD 基因的分离 | 第98-111页 |
| ·C. thermophilum CuZn-SOD 基因中间片段的分离 | 第98-100页 |
| ·C. thermophilum CuZn-SOD 基因cDNA 3’-末端的分离 | 第100-102页 |
| ·C. thermophilum CuZn-SOD 基因全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接 | 第102-103页 |
| ·嗜热毛壳菌CuZn-SOD Genomic DNA 的扩增 | 第103-105页 |
| ·C. thermophilum CuZn-SOD 基因的核苷酸和氨基酸序列分析 | 第105-111页 |
| ·CuZn-SOD 基因的核苷酸序列分析 | 第106-107页 |
| ·CuZn-SOD 基因的氨基酸序列分析 | 第107-111页 |
| 3. 讨论 | 第111-115页 |
| 第四章 嗜热毛壳菌CUZN-SOD 基因在毕赤酵母中的表达 | 第115-143页 |
| 1. 材料和方法 | 第115-127页 |
| ·材料 | 第115-117页 |
| ·菌株和质粒 | 第115页 |
| ·酶和生化试剂 | 第115-116页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第116-117页 |
| ·主要仪器设备 | 第117页 |
| ·实验方法 | 第117-127页 |
| ·CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离 | 第117-118页 |
| ·CuZn-SOD 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第117页 |
| ·引物设计和CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离 | 第117-118页 |
| ·CuZn-SOD 基因在毕赤酵母中的表达 | 第118-127页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第119页 |
| ·线性化质粒DNA 的制备 | 第119-120页 |
| ·酵母转化 | 第120-122页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第122-123页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第123-124页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第124-125页 |
| ·酵母工程菌的培养和CuZn-SOD 的诱导分泌表达 | 第125-126页 |
| ·表达产物的生物学活性检测 | 第126页 |
| ·表达产物CuZn-SOD 的SDS-PAGE 分析 | 第126页 |
| ·超氧化物歧化酶工程菌产酶曲线的测定 | 第126页 |
| ·超氧化物歧化酶工程菌的遗传稳定性分析 | 第126-127页 |
| ·超氧化物歧化酶工程菌表达产物的酶学性质 | 第127页 |
| 2. 结果与分析 | 第127-139页 |
| ·CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离 | 第127-129页 |
| ·CuZn-SOD 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果 | 第127-128页 |
| ·CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离 | 第128-129页 |
| ·超氧化物歧化酶基因 cz1 在毕赤酵母中的表达 | 第129-139页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第129-131页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/cz1 转化 Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选 | 第131-134页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第131页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第131-134页 |
| ·cz1 基因多拷贝整合子的筛选 | 第134页 |
| ·嗜热毛壳菌热稳定超氧化物歧化酶 cz1 基因在 Pichia pastoris 中的高 效表达及表达产物的检测 | 第134-136页 |
| ·超氧化物歧化酶 cz1 基因在 Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达 酵母菌株的筛选 | 第134页 |
| ·超氧化物歧化酶酵母工程菌产酶曲线的测定 | 第134-135页 |
| ·甲醇的体积分数对超氧化物歧化酶产量的影响 | 第135-136页 |
| ·超氧化物歧化酶基因 cz1 表达产物的 SDS-PAGE 检测 | 第136页 |
| ·超氧化物歧化酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第136页 |
| ·表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的酶学性质研究 | 第136-139页 |
| ·表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的最适反应温度 | 第136-137页 |
| ·表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的最适反应pH 值 | 第137-138页 |
| ·表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的热稳定性 | 第138页 |
| ·表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的pH 稳定性 | 第138-139页 |
| 3 讨论 | 第139-143页 |
| ·影响Pichia pastoris 表达系统表达重组超氧化物歧化酶的因素 | 第139-143页 |
| 第五章 结论和建议 | 第143-145页 |
| 1 结论 | 第143-144页 |
| 2 建议 | 第144-145页 |
| 参考文献 | 第145-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第162页 |
