| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-29页 |
| 一 DNA 聚合酶δ | 第11-19页 |
| 1 polδ的组成及功能 | 第12-16页 |
| ·polδ是多亚基组成的复合体 | 第12-14页 |
| ·polδ的功能 | 第14-16页 |
| 2 POLD1 基因及其启动子结构研究 | 第16-19页 |
| ·POLD1 基因结构 | 第16-17页 |
| ·POLD1 基因启动子的克隆及功能研究 | 第17-19页 |
| 二 哺乳动物细胞 DNA 复制体及 DNA 复制机制 | 第19-23页 |
| 1 哺乳动物DNA 复制体 | 第20-22页 |
| ·DNA 复制体的组成 | 第20页 |
| ·DNA 复制体核心蛋白的结构及功能 | 第20-21页 |
| ·polδ与PCNA 的相互作用 | 第21-22页 |
| 2 哺乳动物DNA 复制模型 | 第22-23页 |
| 三 细胞周期依赖的 DNA 复制体活性调控 | 第23-27页 |
| 1 DNA 复制过程中的CYCLIN/CDK 复合体转换及其对DNA 复制体的影响 | 第23-24页 |
| 2 CYCLIN/CDK 复合体对DNA 复制体的磷酸化 | 第24-26页 |
| 3 其它细胞周期相关蛋白对DNA 复制体的调控作用 | 第26-27页 |
| 四 POLδ的细胞周期依赖性调控是 DNA 复制体研究的重要内容 | 第27-29页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第29-48页 |
| 一 实验材料 | 第29-30页 |
| 1 菌株 | 第29页 |
| 2 细胞株 | 第29页 |
| 3 质粒 | 第29-30页 |
| 二 主要试剂 | 第30-31页 |
| 1 酶类 | 第30页 |
| 2 抗体 | 第30页 |
| 3 试剂盒和其他主要生化试剂 | 第30-31页 |
| 三 仪器设备 | 第31页 |
| 四 实验方法 | 第31-48页 |
| 1 质粒的构建 | 第31-41页 |
| ·G1 期周期调控因子真核表达载体的构建 | 第31-35页 |
| ·POLD1 启动子各种突变体的构建 | 第35-38页 |
| ·p21 各种突变体质粒的构建及鉴定 | 第38-41页 |
| 2 细胞转染及稳定表达细胞株的筛选 | 第41页 |
| ·细胞培养 | 第41页 |
| ·细胞转染 | 第41页 |
| ·G418 筛选转染细胞系 | 第41页 |
| 3 启动子活性的测定 | 第41-42页 |
| ·细胞转染 | 第41页 |
| ·细胞提取物的制备 | 第41-42页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性的检测 | 第42页 |
| ·荧光素酶活性的检测 | 第42页 |
| 4 蛋白表达量的检测 | 第42-44页 |
| ·蛋白的提取 | 第42-43页 |
| ·蛋白浓度的测定（Bradford 法） | 第43页 |
| ·Western blotting 检测蛋白的表达量 | 第43-44页 |
| 5 RNA 的提取及RT-PCR 检测MRNA 的表达 | 第44-45页 |
| ·RNA 的提取 | 第44页 |
| ·RT-PCR 检测mRNA 的表达 | 第44-45页 |
| 6 染色体免疫共沉淀（CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION，CHIP） | 第45-47页 |
| 7 细胞周期分析 | 第47页 |
| ·TdR 双阻断法进行细胞周期同步化 | 第47页 |
| ·流式细胞光度术（FCM）分析细胞周期 | 第47页 |
| 8 细胞间接免疫荧光（IF）及荧光定位实验 | 第47-48页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第47页 |
| ·p53 荧光定位实验 | 第47-48页 |
| 第三部分 实验结果 | 第48-74页 |
| 一 POLD1 启动子在细胞周期不同时相的活性分析 | 第48-49页 |
| 二 E2F1 对 POLD1 启动子活性的促进作用 | 第49-51页 |
| 1 E2F1 对POLD1 启动子活性的促进 | 第49-50页 |
| ·E2F1 真核表达载体的构建 | 第49页 |
| ·E2F1 能够促进POLD1 启动子活性 | 第49-50页 |
| 2 E2F1 与POLD1 启动子在细胞内的结合 | 第50-51页 |
| 三 G1 期周期调控因子对 POLD1 基因启动子活性的调控 | 第51-56页 |
| 1 真核表达载体的构建及鉴定 | 第51-52页 |
| 2 G1 期周期调控因子对POLD1 启动子活性的影响 | 第52-53页 |
| 3 CDK2 对POLD1 启动子活性的调控 | 第53页 |
| 4 CYCLIN E 对POLD1 启动子活性的调控 | 第53-56页 |
| 四 P53 对 POLD1 基因的表达调控作用 | 第56-62页 |
| 1 P53 对POLD1 基因转录的抑制 | 第56页 |
| 2 P53 对POLD1 启动子活性的抑制 | 第56-57页 |
| ·p53 对POLD1 启动子的抑制具有剂量依赖效应 | 第56-57页 |
| ·p53 能够持续抑制POLD1 启动子活性 | 第57页 |
| 3 P53 在细胞内与POLD1 启动子的结合 | 第57-59页 |
| 4 细胞周期对P53 核转运的调控 | 第59-61页 |
| ·内源性表达的p53 在MCF7 细胞中的定位受到细胞周期的严格调控 | 第59页 |
| ·EGFP-p53 融合蛋白在MCF7 细胞中的核转运也受到细胞周期的严格调控 | 第59-61页 |
| 5 P53 对POLD1 启动子活性的细胞周期非依赖性抑制 | 第61-62页 |
| 五 P21 对 POLD1 基因表达的抑制作用 | 第62-74页 |
| 1 P21 高表达对POLD1 基因MRNA 水平及蛋白表达的影响 | 第62-63页 |
| ·p21 对p125 蛋白表达水平的影响 | 第62页 |
| ·p21 能够抑制POLD1 mRNA 表达 | 第62-63页 |
| 2 P21 对PODL1 启动子活性的抑制 | 第63-64页 |
| ·p21 抑制POLD1 启动子具有剂量依赖效应 | 第63页 |
| ·p21 在一定时间内能够持续抑制POLD1 启动子 | 第63-64页 |
| 3 P21 能够影响E2F1 对POLD1 启动子的激活作用但不影响E2F1 的表达 | 第64-66页 |
| ·p21 能够影响E2F1 对POLD1 启动子的激活作用 | 第64页 |
| ·p21 的高表达不影响E2F1 的表达 | 第64-66页 |
| 4 P21 各种突变体对POLD1 启动子活性的影响 | 第66-68页 |
| ·p21 截短突变对POLD1 启动子的影响 | 第66-67页 |
| ·p21 点突变对POLD1 启动子的抑制作用 | 第67-68页 |
| 5 P21 的抑制作用与POLD1 启动子CDE/CHR 元件的相关性 | 第68-74页 |
| ·POLD1 启动子3’端2306p 区域内可能存在受p21 抑制的调控元件 | 第68-69页 |
| ·POLD1 启动子3’端截取突变体对p21 抑制的敏感性分析 | 第69-71页 |
| ·p21 可以通过CDE/CHR 元件抑制POLD1 启动子活性 | 第71-74页 |
| 第四部分 讨论 | 第74-87页 |
| 一 POLD1 启动子活性受到细胞周期的调控 | 第74-75页 |
| 二 E2F1 在细胞内与POLD1 启动子结合并促进其活性 | 第75页 |
| 三 CYCLIN E/CDK2 复合体参与了POLD1 的表达调控 | 第75-77页 |
| 四 P53 在细胞内与POLD1 启动子，并以细胞周期非依赖方式抑制其活性 | 第77-80页 |
| 1 P53 的高表达能够抑制POLD1 基因MRNA 转录 | 第77-78页 |
| 2 首次证明P53 在细胞内能够直接与POLD1 启动子结合 | 第78页 |
| 3 首次在细胞周期进程中关注P53 对POLD1 启动子的调控 | 第78-80页 |
| ·证明了p53 的亚细胞定位在MCF7 细胞中受到细胞周期的严格调控 | 第78-79页 |
| ·p53 对POLD1 启动子的抑制作用表现出细胞周期非依赖特点 | 第79-80页 |
| 五 P21 参与了POLD1 基因的表达调控 | 第80-85页 |
| 1 首次发现P21 能够抑制POLD1 基因的表达 | 第80-81页 |
| 2 P21 能影响E2F1 对POLD1 启动子的促进作用 | 第81-82页 |
| 3 P21 对POLD1 的抑制机制较为复杂 | 第82-83页 |
| ·p21 可能直接与E2F1 结合而抑制POLD1 启动子 | 第82-83页 |
| ·p21 通过其它转录因子抑制POLD1 启动子活性 | 第83页 |
| 4 P21 通过CDE/CHR 元件影响POLD1 启动子活性 | 第83-85页 |
| 六 POLD1 基因的细胞周期表达调控网络 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-103页 |
| 致谢 | 第103-105页 |
| 缩略语表 | 第105-106页 |
| 个人简历 | 第106-107页 |
| 附录：相关质粒的测序结果 | 第107-113页 |
