| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 一 前言 | 第10-18页 |
| 1.核酶的发现及分类 | 第10页 |
| 2.RNASE P简介及其作为分子剪刀的历史 | 第10-12页 |
| 3.关于EGS | 第12-13页 |
| 4.HCMV简介 | 第13-16页 |
| 5.MOUSB U6启动子 | 第16页 |
| 6.UL49—A片段 | 第16-17页 |
| 7.课题意义 | 第17-18页 |
| 二 材料和方法 | 第18-35页 |
| 1 主要仪器设备 | 第18页 |
| 2 材料 | 第18-22页 |
| ·细胞株 | 第18-19页 |
| ·质粒和菌株 | 第19页 |
| ·引物和测序 | 第19页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第19-20页 |
| ·培养基的配制 | 第20页 |
| ·细菌培养基的配置 | 第20页 |
| ·细胞培养基的配置 | 第20页 |
| ·血清的处理 | 第20页 |
| ·其他常用试剂的配置 | 第20-22页 |
| ·质粒DNA提取及纯化所需试剂 | 第21页 |
| ·细胞培养常用试剂的配制 | 第21页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所需溶液 | 第21页 |
| ·所需抗生素的配置 | 第21-22页 |
| 3 实验路线及方法 | 第22-35页 |
| ·EGS的设计 | 第22-24页 |
| ·UL49-A片段+GFP片段二级结构的模拟 | 第22页 |
| ·EGS的设计原则 | 第22-23页 |
| ·靶位点的搜寻 | 第23-24页 |
| ·EGS的克隆 | 第24-28页 |
| ·EGS克隆技术路线 | 第24页 |
| ·EGS克隆引物的设计 | 第24-25页 |
| ·PCR扩增mU6+EGS片段 | 第25-26页 |
| ·凝胶回收纯化 | 第26页 |
| ·载体pcDNA3.1-的制备 | 第26页 |
| ·插入片段(mU6+EGS)和载体(pcDNA3.1-)的双酶切、连接 | 第26-27页 |
| ·制备感受态 | 第27页 |
| ·转化 | 第27页 |
| ·快速抽提法抽提质粒验证 | 第27-28页 |
| ·底物片段UL49-A的克隆 | 第28-30页 |
| ·底物片段UL49-A克隆技术路线 | 第28页 |
| ·底物片段UL49-A两端引物的设计 | 第28页 |
| ·PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·凝胶回收纯化 | 第29页 |
| ·载体pEGFP-Nl的制备 | 第29页 |
| ·插入片段(UL49-A片段)和载体(pEGFP-Nl)的双酶切、连接 | 第29页 |
| ·制备感受态 | 第29-30页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·快速抽提法抽提质粒验证 | 第30页 |
| ·细胞复苏和细胞冻存 | 第30页 |
| ·细胞转染 | 第30页 |
| ·TYPHOON扫描 | 第30页 |
| ·流式细胞仪实验 | 第30-31页 |
| ·RNA的抽提 | 第31页 |
| ·RNA的纯化 | 第31-32页 |
| ·RT-PCR | 第32-33页 |
| ·RT-PCR检测UL49-A片段在胞内的表达 | 第32-33页 |
| ·RT-PCR检测EGS在胞内的表达 | 第33页 |
| ·REAL-TTME PCR | 第33-35页 |
| 三 结果与分析 | 第35-48页 |
| 1 EGS的设计 | 第35-37页 |
| ·UL49-A片段、UL49-A+GFP片段二级结构模拟结果及靶位点的确定 | 第35-37页 |
| ·EGS片段的设计 | 第37页 |
| 2 EGS表达质粒的构建 | 第37-38页 |
| 3 UL49-A表达质粒的构建 | 第38-40页 |
| 4 EGS对HCMVUL49基因表达的抑制作用 | 第40-48页 |
| ·TYPHOON扫描 | 第40-42页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第42-44页 |
| ·RT-PCR结果 | 第44-45页 |
| ·RT-PCR检测UL49-A片段在胞内的表达 | 第44-45页 |
| ·RT-PCR检测EGS在胞内的表达 | 第45页 |
| ·REAL TIME PCR结果 | 第45-48页 |
| 四 讨论 | 第48-53页 |
| 1 EGS的设计 | 第48-49页 |
| 2 EGS的可能用途 | 第49-51页 |
| 3 EGS的不足 | 第51-52页 |
| 4 CMV和U6双启动子 | 第52-53页 |
| 五 结论 | 第53-54页 |
| 六 附录 | 第54-57页 |
| 附录1 U6-PLXSN测序结果 | 第54页 |
| 附录2 PEGFP-Nl载体测序结果 | 第54页 |
| 附录3 UL49-A-GFP测序结果 | 第54-55页 |
| 附录4 PDU6-EGS1测序结果 | 第55页 |
| 附录5 PDU6-EGS2测序结果 | 第55页 |
| 附录6 PDU6-EGS3测序结果 | 第55页 |
| 附录7 PDU6-EGS4测序结果 | 第55-56页 |
| 附录8 PDU6-EGS5测序结果 | 第56页 |
| 附录9 PDU6-EGS6测序结果 | 第56-57页 |
| 七 参考文献 | 第57-60页 |
| 八 致谢 | 第60页 |
