| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-32页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎及其危害 | 第11-12页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎的病原学 | 第12-13页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌的发现 | 第12页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌的特征 | 第12-13页 |
| ·RTX毒素家族研究进展 | 第13-22页 |
| ·RTX毒素特征 | 第14-15页 |
| ·RTX毒素水溶性膜蛋白模型 | 第15-17页 |
| ·RTX毒素的功能 | 第17页 |
| ·RTX毒素蛋白的转运 | 第17-18页 |
| ·RTX毒素的黏附 | 第18-19页 |
| ·RTX溶血毒素与细胞毒素识别特异性靶细胞 | 第19-20页 |
| ·RTX毒素受体 | 第20-21页 |
| ·RTX毒素诱导的细胞死亡机制 | 第21-22页 |
| ·负向选择标记:细菌遗传学和病原学研究中的新工具 | 第22-32页 |
| ·使用负向选择标记的正负双向筛选系统的组成 | 第22-24页 |
| ·负向选择标记的正负双向筛选系统的重组机制及研究方向 | 第24-28页 |
| ·负向选择标记用于研究致病机理并构建候选疫苗 | 第28-32页 |
| 第2章 胸膜肺炎放线杆菌血清1型 RTX毒素 I的N-端多肽免疫原性研究 | 第32-51页 |
| ·研究目的及意义 | 第32-33页 |
| ·材料 | 第33-37页 |
| ·质粒、菌株、细胞及动物 | 第33页 |
| ·培养基及抗生素 | 第33-34页 |
| ·引物 | 第34页 |
| ·酶及试剂盒 | 第34页 |
| ·质粒抽提与鉴定试剂 | 第34-35页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 | 第35页 |
| ·Western-blot相关溶液 | 第35-36页 |
| ·ELISA缓冲液 | 第36页 |
| ·溶血试验所用溶液 | 第36页 |
| ·其他试剂 | 第36-37页 |
| ·实验方法 | 第37-42页 |
| ·细菌的增殖及基因组的提取 | 第37页 |
| ·apxIA基因全长克隆与序列测定 | 第37-38页 |
| ·PCR产物的回收与电泳检测 | 第38页 |
| ·apxIA基因及其编码蛋白的生物信息学分析 | 第38-39页 |
| ·apxIA基因5’端1140bp编码区的克隆与序列测定 | 第39-40页 |
| ·重组表达质粒的构建与酶切鉴定 | 第40页 |
| ·诱导表达、表达产物的纯化及 Western-blot分析 | 第40-41页 |
| ·天然 ApxI毒素的提取及SDS-PAGE鉴定 | 第41-42页 |
| ·实验动物分组及免疫剂量，免疫周期 | 第42页 |
| ·天然毒素 ELISA最佳工作浓度的确定及实验动物抗体水平检测 | 第42页 |
| ·天然毒素的溶血素单位测定及血清毒素中和抗体水平检测 | 第42页 |
| ·实验动物的攻毒 | 第42页 |
| ·结果与分析 | 第42-48页 |
| ·apxIA基因全长和5’端1140bp编码区的克隆，序列测定 | 第42-43页 |
| ·apxIA基因及其编码蛋白的生物信息学分析 | 第43-44页 |
| ·原核表达载体的的构建及酶切鉴定 | 第44页 |
| ·pET-IA及pET-IA5的诱导表达及 Western-blot分析 | 第44-45页 |
| ·天然毒素 ApxI的提取及 SDS-PAGE鉴定 | 第45-46页 |
| ·间接 ELISA检测免疫小鼠血清的抗体水平 | 第46页 |
| ·溶血中和抗体的检测结果 | 第46-47页 |
| ·小鼠攻毒保护试验结果 | 第47-48页 |
| ·讨论 | 第48-50页 |
| ·ApxIA的免疫原性预测 | 第48-49页 |
| ·N端多肽的溶血中和作用 | 第49页 |
| ·动物试验的攻毒及免疫保护 | 第49-50页 |
| ·结论 | 第50-51页 |
| 第3章 表达APXIA的重组胸膜肺炎放线杆菌血清7型候选疫苗菌株突变体的研究 | 第51-67页 |
| ·研究目的及意义 | 第51页 |
| ·实验材料 | 第51-54页 |
| ·细菌菌株 | 第51页 |
| ·载体与质粒 | 第51-53页 |
| ·主要培养基和抗生素 | 第53页 |
| ·本研究中所用的寡核苷酸引物 | 第53-54页 |
| ·实验方法 | 第54-57页 |
| ·细菌的增殖及基因组的提取 | 第54页 |
| ·apxIIC基因的克隆及序列分析 | 第54页 |
| ·apxIIXCA基因的PCR扩增及转移载体pSKPP的构建 | 第54页 |
| ·apxIIXCA基因上游长片段的克隆及pSKPP同源左臂的替换 | 第54页 |
| ·apxIA 5’端1140bp片段PCR扩增及插入载体pSKPP和pSKPP' | 第54-55页 |
| ·内部缺失180bp pSKPP△C载体的构建 | 第55页 |
| ·npt II-SacB表达盒的引入 | 第55页 |
| ·六种不同重组质粒在大肠杆菌中的功能验证 | 第55-56页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌电转化感受态细胞的制备 | 第56页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌电转化 | 第56页 |
| ·负向选择方法筛选突变株 | 第56-57页 |
| ·结果与分析 | 第57-61页 |
| ·apxIIC基因的克隆及序列分析 | 第57-58页 |
| ·apxIIXCA基因的PCR扩增及转移载体pSKPP的构建 | 第58页 |
| ·apxIICA理基因上游长片段的克隆及pSKPP同源左臂的替换 | 第58-59页 |
| ·apxIA 5’端1140np片段PCR扩增及插入载体pSKPP和pSKPP' | 第59页 |
| ·内部缺失180bp pSKPP△C载体的构建 | 第59-60页 |
| ·npt II-SacB表达盒的引入 | 第60页 |
| ·六种不同重组质粒在大肠杆菌中的功能验证 | 第60页 |
| ·重组转移质粒电转化及基因工程突变株筛选 | 第60-61页 |
| ·讨论 | 第61-66页 |
| ·构建三种重组质粒的目的 | 第61-62页 |
| ·未筛选到突变株的原因 | 第62-64页 |
| ·试验改进的方向 | 第64-66页 |
| ·结论 | 第66-67页 |
| 4. 小结与展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-76页 |
| 附录 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
