| 缩略词表 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 综述 | 第13-32页 |
| ·课题的提出 | 第13-14页 |
| ·马铃薯AGPase的研究进展 | 第14-23页 |
| ·马铃薯淀粉合成过程中的主要酶类 | 第14-15页 |
| ·马铃薯AGPase的分子结构 | 第15-16页 |
| ·马铃薯AGPase的酶活性调节方式 | 第16-18页 |
| ·马铃薯AGPase配体结合位点 | 第18-20页 |
| ·底物结合位点 | 第18页 |
| ·激活因子位点 | 第18-19页 |
| ·抑制因子结合位点 | 第19-20页 |
| ·马铃薯AGPase定位与表达调控 | 第20-21页 |
| ·AGPase与块茎的淀粉合成 | 第21-22页 |
| ·AGPase的应用 | 第22-23页 |
| ·马铃薯基因功能研究的外源表达系统和抑制系统 | 第23-30页 |
| ·外源表达系统 | 第23-27页 |
| ·甲醇酵母外源表达系统的特点 | 第23-24页 |
| ·Pichia methanolica表达系统 | 第24-25页 |
| ·外源基因整合到Pichia methanolica基因组中 | 第25-26页 |
| ·外源蛋白在甲醇酵母中的高效表达策略 | 第26-27页 |
| ·反义RNA和RNAi技术 | 第27-30页 |
| ·反义RNA技术作用原理 | 第27-28页 |
| ·反义RNA技术在植物基因工程中的应用 | 第28-29页 |
| ·RNAi技术及作用机制 | 第29-30页 |
| ·RNAi技术在功能基因研究中的应用 | 第30页 |
| ·研究的目的及意义 | 第30-32页 |
| 第二章 材料与方法 | 第32-44页 |
| ·RNA与DNA的提取 | 第32-35页 |
| ·叶片总RNA的提取(用于反转录和Northern分析) | 第32页 |
| ·马铃薯块茎总RNA的提取(用于反转录和Northern分析) | 第32-33页 |
| ·DNA的去除 | 第33页 |
| ·马铃薯叶片DNA小量抽提(用于转基因植株PCR检测) | 第33-34页 |
| ·马铃薯植株DNA的抽提与纯化(用于Southern杂交) | 第34-35页 |
| ·质粒的抽提及转化 | 第35-37页 |
| ·质粒DNA小量制备 | 第35页 |
| ·质粒DNA大量制备 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第36-37页 |
| ·农杆菌感受态制备与遗传转化 | 第37页 |
| ·农杆菌感受态的制备及转化 | 第37页 |
| ·农杆菌介导的基因转化 | 第37页 |
| ·转基因植株的Northern杂交 | 第37-39页 |
| ·转基因植株的Southern杂交 | 第39-42页 |
| ·总DNA的预酶切和酶切 | 第39-40页 |
| ·电泳转膜 | 第40-41页 |
| ·预杂交 | 第41页 |
| ·探针标记 | 第41-42页 |
| ·杂交 | 第42页 |
| ·洗膜与放射性自显影 | 第42页 |
| ·转基因植株酶活性、淀粉和还原糖的提取与测定 | 第42-44页 |
| ·AGPase的提取和活性测定 | 第43页 |
| ·淀粉和还原糖提取与含量测定 | 第43-44页 |
| 第三章 马铃薯sAGP cDNA的克隆及其在甲醇酵母中的表达 | 第44-61页 |
| ·材料和方法 | 第44-51页 |
| ·植物材料、菌种和试剂 | 第44-45页 |
| ·培养基及缓冲液的配制 | 第45-46页 |
| ·培养基配制 | 第45页 |
| ·缓冲液配制 | 第45-46页 |
| ·RNA的提取 | 第46页 |
| ·RT-PCR、RACEs与全长sAGP cDNA的克隆 | 第46-48页 |
| ·第一链逆转录与双链cDNA合成 | 第46页 |
| ·5′和3′RACE | 第46-48页 |
| ·重叠延伸扩增全长cDNA | 第48页 |
| ·PCR产物的克隆与测序 | 第48页 |
| ·重组表达载体pMETα-A4的构建 | 第48-49页 |
| ·酵母感受态细胞制备与电击转化 | 第49-50页 |
| ·重组表达载体线性化与电击转化酵母 | 第50页 |
| ·毕赤甲醇酵母总DNA的抽提与重组酵母的鉴定 | 第50页 |
| ·重组酵母的诱导表达与SDS-PAGE电泳 | 第50-51页 |
| ·诱导重组酵母中AGPase活性测定 | 第51页 |
| ·结果与分析 | 第51-59页 |
| ·5′RACE、3′RACE及重叠延伸PCR | 第51-52页 |
| ·扩增产物的克隆与验证 | 第52-53页 |
| ·sAGP基因cDNA分子特征与序列分析 | 第53-57页 |
| ·酵母表达载体构建 | 第57-58页 |
| ·重组子的筛选与重组酵母的PCR鉴定 | 第58页 |
| ·sAGP在甲醇酵母中的表达及SDS-PAGE电泳分析 | 第58-59页 |
| ·诱导重组酵母中AGPase活性测定 | 第59页 |
| ·讨论 | 第59-61页 |
| 第四章 载体构建与植株再生研究 | 第61-71页 |
| ·材料与方法 | 第61-63页 |
| ·植物材料、菌株和质粒 | 第61页 |
| ·拟南芥转运肽的克隆 | 第61-62页 |
| ·载体构建 | 第62-63页 |
| ·sAGP基因与转运肽At81融合 | 第62页 |
| ·组成型表达载体pBISA和pBIRA构建 | 第62-63页 |
| ·块茎特异表达载体pBICA和pBICRA构建 | 第63页 |
| ·转化再生植株起源的细胞学观察 | 第63页 |
| ·结果与分析 | 第63-69页 |
| ·拟南芥转运肽的克隆 | 第63-64页 |
| ·At81测序与序列分析 | 第64-65页 |
| ·sAGP基因与转运肽At81融合 | 第65-66页 |
| ·组成型表达载体构建 | 第66页 |
| ·块茎特异表达载体构建 | 第66-67页 |
| ·转化再生植株起源的形态变化 | 第67-68页 |
| ·转化植株再生起源的细胞学观察 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 CaMV35S驱动的正、反义sAGP基因表达及对马铃薯茎淀粉和还原糖含量的影响 | 第71-78页 |
| ·材料与方法 | 第71-72页 |
| ·植物材料 | 第71页 |
| ·马铃薯的遗传转化 | 第71-72页 |
| ·转基因植株的PCR、Southern和Northern杂交检测 | 第72页 |
| ·转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量测定 | 第72页 |
| ·结果与分析 | 第72-76页 |
| ·转基因马铃薯的获得与分子鉴定 | 第72-73页 |
| ·转基因马铃薯块茎中sAGP基因表达分析 | 第73-75页 |
| ·转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量 | 第75-76页 |
| ·讨论 | 第76-78页 |
| 第六章 sAGP基因在马铃薯块茎中特异表达及其抗“低温糖化”功能研究 | 第78-87页 |
| ·材料与方法 | 第78-79页 |
| ·植物材料与菌株 | 第78页 |
| ·马铃薯的遗传转化 | 第78页 |
| ·转基因植株的PCR、Southern和Northern杂交检测 | 第78-79页 |
| ·转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量测定 | 第79页 |
| ·结果与分析 | 第79-85页 |
| ·转基因马铃薯的获得与分子鉴定 | 第79-80页 |
| ·转基因马铃薯块茎中sAGP基因表达分析 | 第80-81页 |
| ·转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量变化 | 第81-83页 |
| ·正义和反义sAGP基因的表达对块茎抗“低温糖化”能力的影响 | 第83-85页 |
| ·讨论 | 第85-87页 |
| 第七章 马铃薯干涉体系的建立及sAGP基因功能的进一步验证 | 第87-94页 |
| ·材料与方法 | 第87-89页 |
| ·植物材料、菌株与载体 | 第87页 |
| ·sAGP基因RNAi载体构建与遗传转化 | 第87-88页 |
| ·转基因植株的PCR和Northern杂交检测 | 第88-89页 |
| ·转基因马铃薯植株AGPase活性测定 | 第89页 |
| ·结果与分析 | 第89-92页 |
| ·干涉载体构建 | 第89-90页 |
| ·转基因马铃薯的获得与分子鉴定 | 第90-91页 |
| ·转基因马铃薯植株中sAGP基因表达分析 | 第91页 |
| ·转基因马铃薯植株AGPase活性测定 | 第91-92页 |
| ·讨论 | 第92-94页 |
| 第八章 讨论 | 第94-98页 |
| ·sAGP基因在调节马铃薯块茎淀粉-糖代谢中的作用 | 第94页 |
| ·sAGP的可能作用机制 | 第94-95页 |
| ·sAGP的有效利用 | 第95-96页 |
| ·后续研究展望 | 第96-98页 |
| ·sAGP基因的定点突变研究 | 第96页 |
| ·其他代谢调节基因与sAGP的同时利用 | 第96-97页 |
| ·专一特异启动子的发现与利用 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-112页 |
| 附录 | 第112-120页 |
| 致谢 | 第120页 |
