| 论文摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 英文缩略词表 | 第14-16页 |
| 第1章 文献综述 | 第16-51页 |
| 1．1 禽流感的研究进展 | 第16-45页 |
| 1．1．1 禽流感的发现、分布及其危害 | 第16-22页 |
| 1．1．1．1 禽流感的发现 | 第16页 |
| 1．1．1．2 禽流感在世界的分布及其危害 | 第16-21页 |
| 1．1．1．3 禽流感在我国的分布与危害 | 第21-22页 |
| 1．1．2 禽流感的病原学特征 | 第22-26页 |
| 1．1．2．1 禽流感的分类、命名及其进化 | 第22-24页 |
| 1．1．2．2 禽流感病毒的形态结构 | 第24页 |
| 1．1．2．3 禽流感病毒的理化特性 | 第24-26页 |
| 1．1．2．4 禽流感病毒的实验室宿主系统 | 第26页 |
| 1．1．3 禽流感病毒的分子生物学研究进展 | 第26-34页 |
| 1．1．3．1 病毒基因组结构及表达产物的功能 | 第26-31页 |
| 1．1．3．2 AIV的复制 | 第31-32页 |
| 1．1．3．3 流感病毒的遗传变异 | 第32-34页 |
| 1．1．4 禽流感的流行病学特征 | 第34-35页 |
| 1．1．4．1 易感动物 | 第34页 |
| 1．1．4．2 传染途径 | 第34-35页 |
| 1．1．4．3 潜伏期 | 第35页 |
| 1．1．4．4 流行季节 | 第35页 |
| 1．1．4．5 发病率和死亡率 | 第35页 |
| 1．1．5 禽流感的临床症状及其病理变化 | 第35-36页 |
| 1．1．5．1 临床症状 | 第35页 |
| 1．1．5．2 病理变化 | 第35-36页 |
| 1．1．6 禽流感病毒的免疫学 | 第36-38页 |
| 1．1．6．1 体液免疫 | 第36-37页 |
| 1．1．6．2 细胞免疫 | 第37-38页 |
| 1．1．7 禽流感检测方法研究进展 | 第38-40页 |
| 1．1．7．1 病毒的分离鉴定 | 第38页 |
| 1．1．7．2 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 | 第38页 |
| 1．1．7．3 神经氨酸酶抑制试验(NIT) | 第38-39页 |
| 1．1．7．4 琼脂凝胶扩散试验(AGID) | 第39页 |
| 1．1．7．5 病毒中和试验(NT) | 第39页 |
| 1．1．7．6 免疫荧光技术(IFT) | 第39页 |
| 1．1．7．7 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第39-40页 |
| 1．1．7．8 分子生物学诊断技术 | 第40页 |
| 1．1．8 禽流感的防治 | 第40-43页 |
| 1．1．8．1 禽流感的疫苗研究进展 | 第40-43页 |
| 1．1．8．2 禽流感的综合防制 | 第43页 |
| 1．1．9 禽流感的公共卫生意义 | 第43-45页 |
| 1．2 粘膜免疫佐剂研究进展 | 第45-51页 |
| 1．2．1 霍乱毒素(CT)及其 B亚基(CTB)粘膜免疫佐剂研究进展 | 第47-48页 |
| 1．2．2 其它粘膜佐剂研究进展 | 第48-50页 |
| 1．2．2．1 大肠杆菌热敏肠毒素(LT)及其 B亚基(LTB) | 第48-49页 |
| 1．2．2．2 免疫刺激复合物(Immunostimulating complexes，ISCOMs) | 第49页 |
| 1．2．2．3 百日咳毒素(pertusis toxin，PT) | 第49页 |
| 1．2．2．4 胞壁酰二肽(muramyl depeptide，MDP)及其衍生物 | 第49-50页 |
| 1．2．2．5 细菌脂多糖—(Lipopolysaccharide，LPS) | 第50页 |
| 1．2．2．6 博氏疏螺旋体外表蛋白A(Outer surface protein A，OsPA) | 第50页 |
| 1．2．3 粘膜免疫佐剂应用前景 | 第50-51页 |
| 第2章 鸡抗AIV、兔抗 AIV和山羊抗兔 IgG高免血清的制备及山羊抗兔 IgG的HRP标记 | 第51-66页 |
| 2．1 研究的目的和意义 | 第51页 |
| 2．2 材料与方法 | 第51-59页 |
| 2．2．1 材料 | 第51-53页 |
| 2．2．1．1 禽流感病毒(AIV) | 第51页 |
| 2．2．1．2 标准 AIV的琼脂扩散(AGID)抗原和抗体 | 第51页 |
| 2．2．1．3 兔血清 | 第51-52页 |
| 2．2．1．4 SPF鸡胚及实验动物 | 第52页 |
| 2．2．1．5 主要试剂 | 第52页 |
| 2．2．1．6 主要溶液的配制 | 第52-53页 |
| 2．2．2 方法 | 第53-59页 |
| 2．2．2．1 禽流感病毒的增殖与纯化(浓缩) | 第53页 |
| 2．2．2．2 健康兔血清 IgG的粗提及纯化 | 第53-54页 |
| 2．2．2．3 粗提兔血清 IgG的纯化 | 第54-55页 |
| 2．2．2．4 免疫原的乳化 | 第55页 |
| 2．2．2．5 鸡的免疫 | 第55-56页 |
| 2．2．2．6 家兔的免疫 | 第56页 |
| 2．2．2．7 山羊的免疫 | 第56-57页 |
| 2．2．2．8 鸡抗AIV IgG、兔抗AIV IgG和山羊抗兔 IgG的粗提与纯化 | 第57页 |
| 2．2．2．9 山羊抗兔 IgG-HRP的标记 | 第57-58页 |
| 2．2．2．10 山羊抗兔 IgG-HRP标记物的纯化 | 第58页 |
| 2．2．2．11 山羊抗兔IgG-HRP标记物的质量鉴定 | 第58-59页 |
| 2．2．2．12 与同类产品的比较 | 第59页 |
| 2．3 结果与分析 | 第59-63页 |
| 2．3．1 禽流感病毒的增殖与纯化(浓缩) | 第59页 |
| 2．3．2 纯化后兔 IgG的浓度 | 第59页 |
| 2．3．3 血清抗体水平及纯化后的浓度 | 第59-60页 |
| 2．3．3．1 鸡抗AIV血清抗体水平及纯化后的浓度 | 第59-60页 |
| 2．3．3．2 兔抗 AIV血清抗体水平及纯化后的浓度 | 第60页 |
| 2．3．3．3 山羊抗兔 IgG血清抗体水平及纯化后的浓度 | 第60页 |
| 2．3．4 山羊抗兔 IgG-HRp结合物的纯化 | 第60-62页 |
| 2．3．4．1 G-200纯化山羊抗兔 IgG-HRP标记物 | 第60-61页 |
| 2．3．4．2 ELISA纯化山羊抗兔 IgG-HRP标记物 | 第61-62页 |
| 2．3．5 羊抗兔 IgG-HRP的质量鉴定 | 第62页 |
| 2．3．5．1 HRP/IgG mol数比值 | 第62页 |
| 2．3．5．2 山羊抗兔 IgG-HRP效价测定 | 第62页 |
| 2．3．6 与同类产品的比较 | 第62-63页 |
| 2．4 讨论 | 第63-65页 |
| 2．4．1 抗原 | 第63页 |
| 2．4．2 关于免疫程序 | 第63-64页 |
| 2．4．3 关于羊抗兔IgG-HRP结合物的提纯 | 第64-65页 |
| 2．4．4 山羊抗兔 IgG-HRP结合物的质量鉴定 | 第65页 |
| 2．5 小结 | 第65-66页 |
| 第3章 禽流感病毒 ELISA检测方法的建立 | 第66-76页 |
| 3．1 研究目的和意义 | 第66页 |
| 3．2 材料与方法 | 第66-69页 |
| 3．2．1 材料 | 第66-68页 |
| 3．2．1．1 病毒及微生物材料 | 第66页 |
| 3．2．1．2 主要试剂 | 第66-67页 |
| 3．2．1．3 ELISA试剂的配制 | 第67页 |
| 3．2．1．4 主要实验器材 | 第67-68页 |
| 3．2．2 方法 | 第68-69页 |
| 3．2．2．1 夹心 ELISA测定的基本实验步骤 | 第68页 |
| 3．2．2．2 包被抗体(Ab_1)和第二抗体(Ab_2)最佳工作浓度测定 | 第68-69页 |
| 3．2．2．3 敏感性试验及临界点的确定(设3个重复) | 第69页 |
| 3．2．2．4 特异性试验 | 第69页 |
| 3．2．2．5 临床病鸡禽流感夹心 ELISA检测 | 第69页 |
| 3．3 结果与分析 | 第69-74页 |
| 3．3．1 ELISA最佳包被抗体(Ab_2)和兔抗AIV抗体(Ab_1)最佳工作浓度测定结果 | 第69-70页 |
| 3．3．2 已知AIV阳性尿囊液夹心 ELISA的效价测定(敏感性试验) | 第70-71页 |
| 3．3．3 健康鸡群的检测 | 第71页 |
| 3．3．4 其它禽类病毒交叉性试验 | 第71-72页 |
| 3．3．5 特异性阻断试验 | 第72页 |
| 3．3．6 重复性试验结果 | 第72页 |
| 3．3．7 临床病鸡禽流感夹心 ELISA检测结果 | 第72-74页 |
| 3．4 讨论 | 第74-75页 |
| 3．4．1 夹心 ELISA最佳抗体(鸡抗 AIV IgG, Ab_1)包被浓度和兔抗AIV IgG(Ab_2)最佳工作浓度的选择 | 第74页 |
| 3．4．2 夹心ELISA的初步应用 | 第74-75页 |
| 3．5 小结 | 第75-76页 |
| 第4章 禽流感病毒夹心 ELISA诊断试剂盒的研制与应用 | 第76-83页 |
| 4．1 研究目的及意义 | 第76页 |
| 4．2 材料与方法 | 第76-78页 |
| 4．2．1 材料 | 第76页 |
| 4．2．1．1 试剂盒外包装 | 第76页 |
| 4．2．1．2 试剂盒内组份 | 第76页 |
| 4．2．2 方法 | 第76-78页 |
| 4．2．2．1 试剂盒内各组份的制备及质量控制 | 第76-77页 |
| 4．2．2．2 试剂盒的操作步骤及结果判定 | 第77-78页 |
| 4．2．2．3 试剂盒保存期试验 | 第78页 |
| 4．2．2．4 试剂盒的特异性、重复性及敏感性试验 | 第78页 |
| 4．2．2．5 试剂盒的推广应用结果 | 第78页 |
| 4．3 结果与分析 | 第78-81页 |
| 4．3．1 试剂盒的稳定性及保存期试验 | 第78-79页 |
| 4．3．2 不同批次试剂盒的检测差异结果 | 第79页 |
| 4．3．3 试剂盒的特异性、敏感性及重复性结果 | 第79页 |
| 4．3．4 试剂盒的推广应用结果 | 第79页 |
| 4．3．5 鸡禽流感的检测 | 第79-80页 |
| 4．3．6 大雁鹅禽流感感染的检测和诊断 | 第80-81页 |
| 4．3．7 鸭禽流感的检测 | 第81页 |
| 4．4 讨论 | 第81-82页 |
| 4．5 小结 | 第82-83页 |
| 第5章 禽流感病毒核蛋白(NP)基因与霍乱毒素 B亚单位(CTB)基因的融合表达研究 | 第83-103页 |
| 5．1 研究目的及意义 | 第83页 |
| 5．2 材料与方法 | 第83-92页 |
| 5．2．1 材料 | 第83-87页 |
| 5．2．1．1 质粒与菌株 | 第83-85页 |
| 5．2．1．2 培养基 | 第85页 |
| 5．2．1．3 酶、Marker及试剂盒 | 第85页 |
| 5．2．1．4 CTB引物 | 第85页 |
| 5．2．1．5 主要试剂及溶液的配置 | 第85-87页 |
| 5．2．2 方法 | 第87-92页 |
| 5．2．2．1 CTB片段的 PCR扩增 | 第87页 |
| 5．2．2．2 CTB-PCR产物的电泳检测 | 第87页 |
| 5．2．2．3 DNA片段的回收与纯化 | 第87页 |
| 5．2．2．4 PCR产物的克隆 | 第87-88页 |
| 5．2．2．5 大肠杆菌 DH5α、BL21(codon plus)感受态的制备 | 第88页 |
| 5．2．2．6 细菌的转化 | 第88页 |
| 5．2．2．7 碱裂解法小量制备质粒 DNA | 第88-89页 |
| 5．2．2．8 重组质粒的酶切鉴定 | 第89页 |
| 5．2．2．9 原核表达载体的构建 | 第89页 |
| 5．2．2．10 重组质粒的诱导表达 | 第89-91页 |
| 5．2．2．11 SDS-PAGE | 第91页 |
| 5．2．2．12 GST-CTB-NP的Western-blot分析 | 第91-92页 |
| 5．2．2．13 包涵体的制备 | 第92页 |
| 5．2．2．14 包涵体的纯化与复性 | 第92页 |
| 5．3 结果与分析 | 第92-100页 |
| 5．3．1 CTB片段的扩增 | 第92-93页 |
| 5．3．2 CTB基因的克隆、鉴定、测序及分析 | 第93-94页 |
| 5．3．3 重组表达质粒pGEX-KG-CTB的酶切鉴定 | 第94-95页 |
| 5．3．4 重组表达质粒pGEX-KGCN的酶切鉴定 | 第95-96页 |
| 5．3．5 表达产物的 SDS-PAGE结果 | 第96-98页 |
| 5．3．5．1 重组蛋白GST-CTB表达产物的 SDS-PAGE结果 | 第96-97页 |
| 5．3．5．2 重组蛋白GST-CTB-NP表达产物的 SDS-PAGE结果 | 第97-98页 |
| 5．3．6 重组蛋白GST-CTB-NP表达产物的Western-blot检测结果 | 第98页 |
| 5．3．7 包涵体的提取及检测结果 | 第98-100页 |
| 5．3．7．1 重组蛋白GST-CTB-NP包涵体的提取及检测结果 | 第98-99页 |
| 5．3．7．2 重组蛋白GST-CTB包涵体的提取及检测结果 | 第99-100页 |
| 5．4 讨论 | 第100-102页 |
| 5．4．1 CTB基因的克隆 | 第100页 |
| 5．4．2 CTB基因和 CTB-NP融合基因原核表达载体的构建 | 第100-101页 |
| 5．4．3 CTB蛋白和 CTB-NP融合蛋白的表达及包涵体的提取及纯化 | 第101-102页 |
| 5．5 小结 | 第102-103页 |
| 第6章 霍乱毒素 B亚单位、禽流感病毒重组核蛋白粘膜免疫研究 | 第103-114页 |
| 6．1 研究目的及意义 | 第103-104页 |
| 6．2 材料与方法 | 第104-105页 |
| 6．2．1 材料 | 第104页 |
| 6．2．1．1 试验动物 | 第104页 |
| 6．2．1．2 主要试剂 | 第104页 |
| 6．2．1．3 主要溶液的配制 | 第104页 |
| 6．2．2 方法 | 第104-105页 |
| 6．2．2．1 动物的免疫 | 第104-105页 |
| 6．2．2．2 样品的收集 | 第105页 |
| 6．2．2．3 样本的 ELISA检测 | 第105页 |
| 6．2．2．4 数据处理 | 第105页 |
| 6．3 结果与分析 | 第105-111页 |
| 6．3．1 免疫前后鼻腔洗液、气管洗液、肠腔洗液中sIgA-NP的 ELISA检测结果 | 第105-108页 |
| 6．3．2 免疫前后血清 IgG-NP、IgA-NP的 ELISA检测结果 | 第108-111页 |
| 6．4 讨论 | 第111-113页 |
| 6．4．1 关于粘膜免疫 | 第111-112页 |
| 6．4．2 我国禽流感的现状与防制 | 第112页 |
| 6．4．3 关于粘膜疫苗品质评定及其意义 | 第112-113页 |
| 6．5 小结 | 第113-114页 |
| 参考文献 | 第114-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
