| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-17页 |
| 第一部分 pres2基因的合成、表达和初步纯化 | 第17-27页 |
| 一、实验材料及方法 | 第17-21页 |
| (一)、材料 | 第17-18页 |
| (二)、方法 | 第18-21页 |
| 1．preS2全基因合成 | 第18-19页 |
| 2．重组质粒pThioHisA-preS2的构建 | 第19-20页 |
| 3．preS2基因在大肠杆菌中的表达 | 第20页 |
| 4．preS2重组蛋白质的制备 | 第20页 |
| (1) 工程菌的培养 | 第20页 |
| (2) preS2融合蛋白的初步纯化 | 第20页 |
| 5．preS2的Western Blot检测 | 第20-21页 |
| 二、结果与分析 | 第21-24页 |
| (一)、preS2全基因的合成 | 第21页 |
| (二)、重组质粒pThioHisA-preS2的构建及序列分析 | 第21-22页 |
| (三)、preS2基因在大肠杆菌中的表达 | 第22-23页 |
| (四)、preS2重组蛋白的初步纯化 | 第23-24页 |
| (五)、preS2融合蛋白的Western Blot检测 | 第24页 |
| 三、讨论 | 第24-26页 |
| 四、小结 | 第26-27页 |
| 第二部分 毕赤酵母高拷贝整合载体的构建 | 第27-40页 |
| 一、实验材料及方法 | 第27-31页 |
| (一)、材料 | 第27-29页 |
| 1．质粒和菌株 | 第27-28页 |
| 2．工具酶、试剂盒及试剂 | 第28-29页 |
| 3．培养基 | 第29页 |
| (二)、方法 | 第29-31页 |
| 1．酵母整合型重组质粒的改建 | 第29页 |
| 2．重组酵母表达载体的构建 | 第29-30页 |
| (1) 乙肝病毒包膜蛋白编码基因s的PCR扩增 | 第29页 |
| (2) 单拷贝重组质粒的构建 | 第29-30页 |
| (3) 携带多拷贝表达盒重组质粒的体外构建 | 第30页 |
| 3．表达载体在毕赤酵母中的表达 | 第30-31页 |
| (1) 质粒转化P．pastoris宿主菌GS115 | 第30页 |
| (2) 筛选胞内高拷贝 | 第30-31页 |
| (3) 表达菌株甲醇利用表型的鉴定 | 第31页 |
| (4) 诱导表达及表达的检测 | 第31页 |
| 二、结果与分析 | 第31-37页 |
| (一)、酵母整合型重组质粒的改建 | 第31-32页 |
| (二)、重组酵母表达载体的构建 | 第32-36页 |
| 1．基因s的PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2．单拷贝重组质粒的构建 | 第33-34页 |
| 3．携带多拷贝表达盒重组质粒的体外构建 | 第34-36页 |
| (三)、表达载体在毕赤酵母中的表达 | 第36-37页 |
| 三、讨论 | 第37-39页 |
| 四、小结 | 第39-40页 |
| 第三部分 乙型肝炎病毒包膜蛋白M在毕赤酵母中的表达 | 第40-62页 |
| 一、实验材料及方法 | 第40-45页 |
| (一)、材料 | 第40-41页 |
| 1．菌株、质粒、培养基和主要试剂 | 第40-41页 |
| 2．引物 | 第41页 |
| (二)、方法 | 第41-45页 |
| 1．乙肝病毒包膜蛋白编码基因m的PCR扩增 | 第41页 |
| 2．融合基因α-m的构建 | 第41-42页 |
| 3．携带多拷贝表达盒的重组质粒构建 | 第42页 |
| 4．重组Pichia菌株的构建 | 第42-43页 |
| 5．M蛋白的表达 | 第43页 |
| 6．分泌型M蛋白的制备 | 第43-45页 |
| (1) 摇瓶发酵液pH值对分泌表达的影响 | 第44页 |
| (2) 小型发酵罐初探 | 第44页 |
| (3) 产物粗提液的制备及表达水平的推算 | 第44页 |
| (4) 分泌型M蛋白的性质鉴定 | 第44-45页 |
| 二、结果与分析 | 第45-56页 |
| (一)、乙肝病毒包膜蛋白编码基因m的PCR扩增 | 第45页 |
| (二)、融合基因α-m的构建 | 第45-46页 |
| (三)、表达载体的构建 | 第46-49页 |
| (四)、表达菌株的构建 | 第49页 |
| (五)、M蛋白的表达 | 第49-53页 |
| 1．胞内表达 | 第49-51页 |
| 2．分泌表达 | 第51-53页 |
| (六)、分泌型M蛋白的性质鉴定 | 第53-56页 |
| 1．颗粒形成的确定 | 第53-54页 |
| 2．糖苷酶解反应 | 第54-55页 |
| 3．免疫学鉴定 | 第55-56页 |
| 三、讨论 | 第56-61页 |
| 四、小结 | 第61-62页 |
| 第四部分 分泌型重组M蛋白的初步纯化、糖基化程度鉴定及其免疫原性研究 | 第62-77页 |
| 一、实验材料及方法 | 第62-65页 |
| (一)、材料 | 第62-63页 |
| 1．化学试剂和试剂盒 | 第62页 |
| 2．标准乙肝疫苗 | 第62页 |
| 3．空质粒pAO818表达产物的粗提液 | 第62页 |
| 4．实验动物 | 第62-63页 |
| (二)、方法 | 第63-65页 |
| 1．分泌型重组M蛋白的初步纯化 | 第63页 |
| 2．佐剂吸附 | 第63-64页 |
| 3．动物免疫 | 第64-65页 |
| 4．ELISA检测 | 第65页 |
| 二、结果与分析 | 第65-72页 |
| (一)、分泌型重组M蛋白的初步纯化 | 第65-67页 |
| (二)、佐剂的吸附情况 | 第67页 |
| (三)、分泌型重组M蛋白的免疫原性 | 第67-72页 |
| 1．抗体产生的情况 | 第67-70页 |
| (1) 抗-HBs | 第67-69页 |
| (2) 抗-preS2 | 第69-70页 |
| 2．IFN-γ产生的情况 | 第70-72页 |
| 三、讨论 | 第72-75页 |
| 四、小结 | 第75-77页 |
| 总结 | 第77-78页 |
| 展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 综述1 | 第84-107页 |
| 综述2 | 第107-120页 |
| 附录 | 第120-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
| 研究生简介 | 第133页 |
