| 致谢 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 主要缩略词 | 第14-21页 |
| 1 文献综述 | 第21-43页 |
| ·耐辐射球菌 | 第21-32页 |
| ·耐辐射球菌的概况 | 第21-22页 |
| ·耐辐射球菌的形态、结构和生长特性 | 第22-24页 |
| ·耐辐射球菌极端抗性机制 | 第24-31页 |
| ·防范机制 | 第24页 |
| ·耐受机制 | 第24-27页 |
| ·修复机制 | 第27-31页 |
| ·碱基切除修复 | 第27-28页 |
| ·核苷酸切除修复 | 第28页 |
| ·碱基错配修复 | 第28页 |
| ·重组修复 | 第28-30页 |
| ·关于SOS反应和非同源末端重组(NHEJ) | 第30-31页 |
| ·新假说——隐性的DNA双链断裂 | 第31页 |
| ·小结 | 第31-32页 |
| ·双组分(组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白)信号转导系统 | 第32-41页 |
| ·双组分信号转导系统的发现 | 第33页 |
| ·双组分系统的基本结构和作用机制 | 第33-34页 |
| ·反应调节蛋白的多样性 | 第34-35页 |
| ·反应调节蛋白在各种生命活动过程中行使功能 | 第35-40页 |
| ·外界胁迫(Stress) | 第35-36页 |
| ·毒力(Virulence) | 第36-37页 |
| ·趋化性(Chemotaxis) | 第37页 |
| ·生长调节剂 | 第37-38页 |
| ·外源性大分子DNA的摄取 | 第38页 |
| ·内环境稳定(homeostasis) | 第38-40页 |
| ·研究双组分(组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白)系统的意义 | 第40-41页 |
| ·本文的立论依据和研究意义 | 第41-43页 |
| 2 耐辐射球菌反应调节蛋白DR2418的生物信息学分析 | 第43-51页 |
| ·材料与方法 | 第43-44页 |
| ·材料 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-44页 |
| ·结果与分析 | 第44-48页 |
| ·DR2418是具DNA结合结构域的OmpR/PhoB类型RR | 第44-45页 |
| ·基因DR2418在耐辐射球菌基因组中的位置 | 第45页 |
| ·DR2418的核苷酸序列及氨基酸序列 | 第45-46页 |
| ·DR2418蛋白的motif在线分析 | 第46页 |
| ·DR2418蛋白结构域的同源性分析 | 第46-47页 |
| ·耐辐射球菌DR2418同源物进化树分析 | 第47-48页 |
| ·DR2418与其它物种有代表性反应调节蛋白之间的同源性分析 | 第47-48页 |
| ·DR2418与耐辐射球菌内其它反应调节蛋白之间的同源性分析 | 第48页 |
| ·讨论 | 第48-51页 |
| 3 耐辐射球菌DR2418及相关基因突变株的构建 | 第51-61页 |
| ·实验材料与仪器 | 第51-52页 |
| ·菌株和试剂 | 第51页 |
| ·仪器与设备 | 第51-52页 |
| ·实验方法 | 第52-54页 |
| ·菌株培养 | 第52页 |
| ·基因缺失突变菌株的构建方法 | 第52-53页 |
| ·体外"三段连接" | 第52-53页 |
| ·连接产物转化耐辐射球菌 | 第53页 |
| ·突变株的鉴定 | 第53页 |
| ·基因插入突变菌株的构建方法 | 第53-54页 |
| ·电离辐射处理 | 第54页 |
| ·结果和分析 | 第54-59页 |
| ·各种突变菌株的构建 | 第54-58页 |
| ·DR0743缺失突变株的构建 | 第54-55页 |
| ·DR0781插入突变株的构建 | 第55-56页 |
| ·DR2418/DR2419/DR2420突变株的构建 | 第56-58页 |
| ·ΔDR2418ΔPprI双突变株的构建 | 第58页 |
| ·ΔDR0743全突变菌株不能存活 | 第58页 |
| ·ΔDR0781突变菌株对电离辐射不太敏感 | 第58-59页 |
| ·DR2419/DR2420对电离辐射的贡献不大 | 第59页 |
| ·ΔDR2418ΔPprI对电离辐射更敏感 | 第59页 |
| ·讨论 | 第59-61页 |
| 4 耐辐射球菌DR2418突变株特性分析 | 第61-74页 |
| ·材料、试剂与主要设备 | 第61页 |
| ·材料和试剂 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| ·实验方法 | 第61-65页 |
| ·生长曲线测定 | 第61-62页 |
| ·突变频率测定 | 第62页 |
| ·突变体功能补偿株的构建 | 第62页 |
| ·菌株抗逆处理 | 第62页 |
| ·耐辐射球菌细胞辐照处理 | 第62-63页 |
| ·抗氧化活性分析 | 第63页 |
| ·过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性染色分析 | 第63页 |
| ·邻苯三酚自氧化法测SOD活性 | 第63-64页 |
| ·用过氧化氢酶检测试剂盒检测KAT活性 | 第64-65页 |
| ·Western blot实验 | 第65页 |
| ·结果与分析 | 第65-71页 |
| ·突变株MR和野生株R1的生长曲线基本一致 | 第65页 |
| ·突变株MR的自然突变频率没有发生变化 | 第65-66页 |
| ·突变株MR对各种逆境很敏感 | 第66-67页 |
| ·突变株MR的抗氧化活性降低 | 第67-69页 |
| ·突变株MR中RecA蛋白和PprA蛋白表达量下降 | 第69-70页 |
| ·双突变株ΔDR2418ΔPprI(MD)对各种逆境更敏感 | 第70-71页 |
| ·讨论 | 第71-74页 |
| 5 耐辐射球菌DR2418突变株转录谱分析 | 第74-94页 |
| ·材料与试剂 | 第74-76页 |
| ·耐辐射球菌基因芯片的制备 | 第74-75页 |
| ·RNA抽提、逆转录、芯片杂交及Q-RT-PCR所用试剂 | 第75-76页 |
| ·实验方法 | 第76-80页 |
| ·耐辐射球菌总RNA的分离 | 第76页 |
| ·芯片探针的制备 | 第76-77页 |
| ·芯片预杂交和杂交 | 第77-78页 |
| ·芯片扫描及数据分析 | 第78页 |
| ·实时定量PCR | 第78-79页 |
| ·耐辐射球菌脉冲场电泳(PFGE)方法 | 第79-80页 |
| ·用凝胶包埋法制备耐辐射球菌基因组 | 第79-80页 |
| ·耐辐射球菌脉冲场电泳流程 | 第80页 |
| ·结果与分析 | 第80-91页 |
| ·突变株MR转录谱明显改变 | 第80-85页 |
| ·在自然生长状态下基因DR2418的缺失导致了众多基因转录水平的下调 | 第81-82页 |
| ·电离辐射胁迫下突变株MR的转录谱与非胁迫下的转录谱相似 | 第82-85页 |
| ·突变株中抑制基因和野生株中辐射诱导基因的重叠 | 第85-89页 |
| ·Q-RT-PCR方法验证芯片数据 | 第89-90页 |
| ·DR2418的缺失使γ-射线处理后的基因组重建迟滞 | 第90-91页 |
| ·讨论 | 第91-94页 |
| 6 耐辐射球菌DR2418蛋白的体外活性研究 | 第94-107页 |
| ·材料、试剂与设备 | 第94-95页 |
| ·菌株与质粒 | 第94页 |
| ·主要试剂 | 第94页 |
| ·主要仪器与设备 | 第94-95页 |
| ·实验方法 | 第95-98页 |
| ·大肠杆菌感受态制备 | 第95页 |
| ·DR2418基因的克隆 | 第95页 |
| ·DR2418蛋白表达质粒的构建 | 第95页 |
| ·DR2418蛋白的表达 | 第95-96页 |
| ·DR2418蛋白的纯化 | 第96页 |
| ·定点突变 | 第96页 |
| ·体外蛋白质磷酸化 | 第96-97页 |
| ·凝胶迁移实验 | 第97-98页 |
| ·DR2418蛋白兔多克隆抗血清的制备 | 第98页 |
| ·Western blot实验 | 第98页 |
| ·结果与分析 | 第98-104页 |
| ·DR2418基因ORF的实际长度为666 bp | 第98页 |
| ·DR2418蛋白体外表达量大且可溶 | 第98-99页 |
| ·氨基酸位点Asp54突变使DR2418蛋白失活 | 第99-100页 |
| ·DR2418蛋白能与基因DR0997的启动子特异性结合 | 第100-101页 |
| ·电离辐射前后耐辐射球菌体内基因DR0997的动态转录水平 | 第101-103页 |
| ·突变体YR1中DR2418蛋白表达量下降 | 第103-104页 |
| ·讨论 | 第104-107页 |
| 7 利用TAP技术研究耐辐射球菌体内蛋白互作 | 第107-121页 |
| ·材料与试剂 | 第108-109页 |
| ·质粒、材料和主要试剂 | 第108页 |
| ·溶液的配制 | 第108-109页 |
| ·实验方法 | 第109-112页 |
| ·耐辐射球菌细胞内的质粒提取 | 第109页 |
| ·用SOE法进行体外三段连接 | 第109页 |
| ·TAP标签的选择 | 第109-110页 |
| ·样品的制备及纯化过程 | 第110-112页 |
| ·细胞抽提液的准备 | 第110-111页 |
| ·上清液与IgG树脂结合 | 第111页 |
| ·用TEV蛋白酶切割标签 | 第111页 |
| ·洗脱液与Calmodulin树脂结合 | 第111页 |
| ·从Calmodulin树脂上洗脱下来 | 第111-112页 |
| ·TEV蛋白酶的表达与纯化 | 第112页 |
| ·结果与分析 | 第112-119页 |
| ·pBS1479∶∶KANA质粒的构建 | 第112-113页 |
| ·pRADN和pRADC质粒的构建 | 第113页 |
| ·RecA-CTAP原位融合表达菌株的构建 | 第113-115页 |
| ·DR2418-CTAP原位融合表达菌株的构建 | 第115-116页 |
| ·PprI-CTAP和NTAP-PprI互补融合表达菌株的构建 | 第116-118页 |
| ·靶蛋白(与TAP标签融合)互作蛋白的筛选 | 第118-119页 |
| ·讨论 | 第119-121页 |
| 8 总结与展望 | 第121-125页 |
| 参考文献 | 第125-137页 |
| 作者简历 | 第137页 |
