| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 符号与缩略语 | 第13-15页 |
| 前言 | 第15-29页 |
| 1 RNA 干扰技术 | 第15-25页 |
| ·RNA 干扰现象的发现 | 第15-16页 |
| ·siRNA 介导的RNAi 作用机制 | 第16-19页 |
| ·siRNA 的产生 | 第16页 |
| ·RISC 的组装 | 第16-17页 |
| ·切割目的mRNA | 第17-18页 |
| ·RNAi 的放大效应 | 第18-19页 |
| ·RISC 的关键组分 | 第19-21页 |
| ·Dicer 酶 | 第19页 |
| ·siRNA | 第19-20页 |
| ·Argonaute 蛋白家族 | 第20-21页 |
| ·其他大分子 | 第21页 |
| ·siRNA 设计规则研究 | 第21-22页 |
| ·siRNA 的在线设计 | 第22-23页 |
| ·siRNA 的制备方法 | 第23页 |
| ·siRNA 表达载体 | 第23-24页 |
| ·RNAi 的应用 | 第24-25页 |
| 2 PTTG1 基因的生物学特性 | 第25-28页 |
| ·PTTG1 基因的表达特性 | 第25-26页 |
| ·PTTG1 基因的功能 | 第26-28页 |
| ·PTTG1 与姐妹染色单体的分离 | 第26页 |
| ·PTTG1 与细胞周期调控 | 第26-27页 |
| ·PTTG1 与肿瘤的发生 | 第27-28页 |
| 3 研究目的与意义 | 第28-29页 |
| 材料与方法 | 第29-55页 |
| 1 材料 | 第29-40页 |
| ·载体 | 第29页 |
| ·受体菌 | 第29页 |
| ·细胞系及细胞培养 | 第29-30页 |
| ·引物和测序 | 第30页 |
| ·主要仪器与设备 | 第30-31页 |
| ·主要试剂 | 第31-32页 |
| ·主要溶液的配制 | 第32-40页 |
| 2 方法 | 第40-55页 |
| ·RNA 干扰位点的选择和siRNA 表达序列的确定 | 第40-41页 |
| ·RNA 干扰位点的选择 | 第40页 |
| ·siRNA 序列的选择 | 第40页 |
| ·shRNA 表达序列的确定 | 第40-41页 |
| ·PTTG1 基因RNAi 质粒的构建 | 第41-45页 |
| ·DNA 单链的退火 | 第41页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第41-42页 |
| ·EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切plk0.1-puro 质粒载体 | 第42页 |
| ·胶回收酶切成功的质粒 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的构建 | 第43页 |
| ·制备大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第43页 |
| ·重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞 | 第43-44页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第44-45页 |
| ·质粒纯度和浓度测定 | 第45页 |
| ·质粒的无菌化处理 | 第45页 |
| ·嘌呤霉素对细胞存活的影响 | 第45-46页 |
| ·复苏培养Hep-2 细胞 | 第45-46页 |
| ·嘌呤霉素对细胞存活的影响 | 第46页 |
| ·不同质粒浓度的干扰效果 | 第46-51页 |
| ·细胞预培养 | 第46-47页 |
| ·不同浓度的质粒转染 | 第47-48页 |
| ·嘌呤霉素筛选 | 第48页 |
| ·细胞形态学观察 | 第48页 |
| ·RT-PCR 检测干扰效率 | 第48-50页 |
| ·Western Blot 凝胶电泳检测蛋白表达 | 第50-51页 |
| ·比较不同干扰时间的抑制率 | 第51-55页 |
| ·细胞的预培养和转染 | 第52页 |
| ·嘌呤霉素筛选 | 第52页 |
| ·RT-PCR 检测干扰效率 | 第52-53页 |
| ·Western blot 检测干扰效率 | 第53-55页 |
| 结果 | 第55-67页 |
| 1 siRNA 序列的设计与筛选 | 第55页 |
| 2 DNA 单链的退火结果 | 第55-56页 |
| 3 EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切plk0.1-puro 质粒载体 | 第56页 |
| 4 EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒 | 第56-57页 |
| 5 测序鉴定重组质粒 | 第57页 |
| 6 质粒浓度和纯度测定 | 第57-58页 |
| 7 嘌呤霉素对Hep-2 细胞存活的影响 | 第58页 |
| 8 细胞形态学观察结果 | 第58-59页 |
| 9 基因抑制效率的检测 | 第59-67页 |
| ·引物设计 | 第59页 |
| ·不同浓度质粒干扰效率的检测结果 | 第59-63页 |
| ·RT-PCR 检测PTTG1 mRNA 相对表达水平 | 第59-61页 |
| ·Western blot 检测PTTG1 蛋白的相对表达水平 | 第61-63页 |
| ·plk0.1-puro/PTTG1a 不同作用时间干扰效率的检测结果 | 第63-67页 |
| ·RT-PCR 检测PTTG1 mRNA 的相对表达水平 | 第63-64页 |
| ·Western blot 检测 PTTG1 蛋白的相对表达水平 | 第64-67页 |
| 讨论 | 第67-71页 |
| 1 RNA 干扰技术的优势 | 第67页 |
| 2 干扰位点的选择 | 第67-68页 |
| 3 影响转染效率的因素 | 第68-69页 |
| 4 干扰效率的评价 | 第69-71页 |
| 结论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-82页 |
| 附录 A plk0.1-puro/PTTG1a 和 plk0.1-puro/PTTG1b 测序结果 | 第82-83页 |
| 附录 B Hep-2 细胞形态观察 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第85-86页 |
