| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 前言 | 第18-53页 |
| 1.1 Hfq蛋白的生物学功能概述 | 第18-24页 |
| 1.2 Hfq蛋白的结构 | 第24页 |
| 1.3 Hfq蛋白的作用机理研究 | 第24-33页 |
| 1.3.1 Hfq与RNA相互作用参与基因转录后调控 | 第25-26页 |
| 1.3.2 Hfq与DNA相互作用参与基因表达调控 | 第26-27页 |
| 1.3.3 Hfq与蛋白相互作用参与基因调控 | 第27页 |
| 1.3.4 hfq表达的调控 | 第27-28页 |
| 1.3.5 Hfq参与细胞代谢过程的调控 | 第28-33页 |
| 1.4 鉴定Hfq调控元的方法 | 第33-39页 |
| 1.4.1 转录组测序分析 | 第33-38页 |
| 1.4.2 蛋白组测序分析 | 第38-39页 |
| 1.5 Hfq直接作用靶标鉴定的方法 | 第39-41页 |
| 1.5.1 RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation RIP) | 第39-40页 |
| 1.5.2 蛋白-蛋白免疫共沉淀联合质谱法 | 第40-41页 |
| 1.6 十字花科黑腐病菌的简介 | 第41-42页 |
| 1.7 十字花科黑腐病菌的致病机理研究进展 | 第42-52页 |
| 1.7.1 主要致病因子 | 第42-47页 |
| 1.7.2 主要的致病调控系统和调控因子 | 第47-52页 |
| 1.8 本研究的目的和意义 | 第52-53页 |
| 第二章 材料与方法 | 第53-100页 |
| 2.1 菌株 | 第53-54页 |
| 2.2 质粒 | 第54-55页 |
| 2.3 引物和探针 | 第55-64页 |
| 2.4 常用抗生素 | 第64页 |
| 2.5 培养基的配制、菌株培养及保存 | 第64-66页 |
| 2.5.1 培养基的配制 | 第64-65页 |
| 2.5.2 菌株培养 | 第65-66页 |
| 2.5.3 菌株保存 | 第66页 |
| 2.6 常用溶液的配制 | 第66-71页 |
| 2.7 常规的分子生物学实验技术和方法 | 第71-78页 |
| 2.7.1 Xcc总DNA的提取 | 第71页 |
| 2.7.2 质粒DNA的提取 | 第71页 |
| 2.7.3 常规PCR技术 | 第71-72页 |
| 2.7.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第72-73页 |
| 2.7.5 DNA纯化 | 第73页 |
| 2.7.6 DNA限制性内切酶酶切 | 第73-74页 |
| 2.7.7 DNA连接 | 第74页 |
| 2.7.8 DNA转化(化学转化) | 第74-75页 |
| 2.7.9 三亲本结合 | 第75-76页 |
| 2.7.10 GUS活性检测 | 第76页 |
| 2.7.11 Xcc菌株总蛋白的提取 | 第76页 |
| 2.7.12 Xcc菌株总RNA的提取 | 第76-77页 |
| 2.7.13 RT-PCR | 第77-78页 |
| 2.7.14 5'-RACE实验 | 第78页 |
| 2.8 生物学表型检测实验 | 第78-82页 |
| 2.8.1 生长曲线检测 | 第78-79页 |
| 2.8.2 胞外酶的平板检测 | 第79-80页 |
| 2.8.3 胞外多糖检测 | 第80页 |
| 2.8.4 运动性检测 | 第80-81页 |
| 2.8.5 HR反应检测 | 第81页 |
| 2.8.6 压力敏感检测 | 第81页 |
| 2.8.7 致病性检测和叶内生长曲线的检测 | 第81-82页 |
| 2.8.8 结晶紫法检测细菌的粘附性 | 第82页 |
| 2.9 sR_(Xcc)-141缺失突变体的构建 | 第82-83页 |
| 2.10 hfq_(Xcc)过量表达菌株的构建 | 第83页 |
| 2.11 启动子-gusA转录融合报告质粒的构建 | 第83-84页 |
| 2.12 体内互补菌株的构建 | 第84-85页 |
| 2.13 Hfq蛋白的表达和纯化 | 第85-88页 |
| 2.13.1 表达载体的构建 | 第85页 |
| 2.13.2 Hfq蛋白的诱导表达 | 第85页 |
| 2.13.3 Hfq蛋白的纯化 | 第85-86页 |
| 2.13.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第86-88页 |
| 2.13.5 蛋白质浓度的测定 | 第88页 |
| 2.14 Western blotting实验 | 第88-90页 |
| 2.14.1 蛋白样品的准备 | 第88页 |
| 2.14.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第88页 |
| 2.14.3 转膜 | 第88-89页 |
| 2.14.4 封闭 | 第89页 |
| 2.14.5 一抗温育 | 第89页 |
| 2.14.6 二抗温育 | 第89页 |
| 2.14.7 显影检测 | 第89-90页 |
| 2.15 凝胶阻滞试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) | 第90-94页 |
| 2.15.1 探针的制备 | 第90-92页 |
| 2.15.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第92页 |
| 2.15.3 样品的制备 | 第92-93页 |
| 2.15.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第93页 |
| 2.15.5 转膜 | 第93页 |
| 2.15.6 化学发光免疫检测 | 第93-94页 |
| 2.16 Northernblotting实验 | 第94-97页 |
| 2.16.1 Xcc总RNA的提取 | 第94页 |
| 2.16.2 RNA探针的制备 | 第94-95页 |
| 2.16.3 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第95页 |
| 2.16.4 转膜和交联 | 第95-96页 |
| 2.16.5 预杂交和杂交 | 第96页 |
| 2.16.6 洗膜 | 第96页 |
| 2.16.7 免疫检测 | 第96-97页 |
| 2.17 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP) | 第97-100页 |
| 2.17.1 8004Hfq3F菌株的构建 | 第97页 |
| 2.17.2 细胞培养 | 第97页 |
| 2.17.3 甲醛交联和收集细胞 | 第97-98页 |
| 2.17.4 超声波裂解细胞 | 第98页 |
| 2.17.5 抗体温育 | 第98页 |
| 2.17.6 过柱共纯化蛋白与RNA复合物 | 第98页 |
| 2.17.7 Western blotting验证Co-IP下来的Hfq蛋白 | 第98-99页 |
| 2.17.8 解交联和RNA的纯化 | 第99页 |
| 2.17.9 Northern blotting验证sR_(Xcc)-141靶标 | 第99页 |
| 2.17.10 蛋白的质谱鉴定 | 第99-100页 |
| 第三章 XC_2515编码RNA分子伴侣Hfq_(Xcc) | 第100-132页 |
| 3.1 引言 | 第100页 |
| 3.2 Xcc 8004基因组上存在hfq同源基因(XC_2515)并与下游基因共转录 | 第100-104页 |
| 3.3 hfq_(Xcc)自身表达不受生长时期的调控 | 第104-110页 |
| 3.3.1 hfq_(Xcc)在丰富培养基和基本培养基中组成型表达 | 第104-105页 |
| 3.3.2 Hfq_(Xcc)可能参与自身表达的转录后调控 | 第105-110页 |
| 3.4 Hfq_(Xcc)具有RNA分子伴侣功能 | 第110-123页 |
| 3.4.1 Hfq_(Xcc)对sR_(Xcc)-141在细胞内的积累是必要的 | 第110-111页 |
| 3.4.2 EMSA证实Hfq_(Xcc)与sR_(Xcc)-141体外结合 | 第111-113页 |
| 3.4.3 Co-IP实验证实Hfq_(Xcc)与sR_(Xcc)-141体内结合 | 第113-119页 |
| 3.4.4 Hfq_(Xcc)不影响sR_(Xcc)-141的转录 | 第119-123页 |
| 3.5 hfq_(Xcc)基因缺失引起的表型缺陷不是通过调控sR_(Xcc)-141引起 | 第123-126页 |
| 3.5.1 sR_(Xcc)-141基因在Xcc 8004基因组上的位置 | 第123页 |
| 3.5.2 sR_(Xcc)-141基因缺失突变体的构建 | 第123-125页 |
| 3.5.3 sR_(Xcc)-141基因缺失不影响致病性等重要表型 | 第125-126页 |
| 3.6 分析与讨论 | 第126-132页 |
| 3.6.1 关于hfq_(Xcc)的转录 | 第126-127页 |
| 3.6.2 关于hfq_(Xcc)自身表达调控 | 第127页 |
| 3.6.3 关于Hfq_(Xcc)对sR_(Xcc)-141在体内积累的影响 | 第127-128页 |
| 3.6.4 关于Hfq_(Xcc)与sR_(Xcc)-141的结合 | 第128-130页 |
| 3.6.5 关于Hfq_(Xcc)对sR_(Xcc)-141转录的影响 | 第130-131页 |
| 3.6.6 关于sR_(Xcc)-141的生物学功能 | 第131-132页 |
| 第四章 Hfq_(Xcc)生物学功能的研究 | 第132-158页 |
| 4.1 引言 | 第132页 |
| 4.2 hfq_(Xcc)的缺失不影响Xcc菌株生长但引起致病力下降等表型变化 | 第132-140页 |
| 4.2.1 hfq_(Xcc)的缺失不影响Xcc菌株的生长 | 第132-134页 |
| 4.2.2 hfq_(Xcc)的缺失导致Xcc菌株的致病力下降但不影响HR | 第134-136页 |
| 4.2.3 hfq_(Xcc)的缺失降低Xcc菌株的胞外淀粉酶、胞外纤维素酶、胞外多糖的合成产量 | 第136-137页 |
| 4.2.4 hfq_(Xcc)的缺失影响Xcc菌株的运动能力 | 第137-138页 |
| 4.2.5 hfq_(Xcc)的缺失影响Xcc对渗透压的耐受能力 | 第138页 |
| 4.2.6 hfq_(Xcc)的缺失不影响生物膜的形成 | 第138-140页 |
| 4.3 hfq_(Xcc)过量表达不影响表型的变化 | 第140-144页 |
| 4.3.1 hfq_(Xcc)过量表达菌株的构建 | 第140-142页 |
| 4.3.2 hfq_(Xcc)过量表达菌株的表型检测 | 第142-144页 |
| 4.4 Hfq_(Xcc)端对Hfq_(Xcc)的功能是必须的 | 第144-151页 |
| 4.4.1 C端的缺失影响hfq_(Xcc)生物学功能 | 第145-149页 |
| 4.4.2 HfqΔ199-279蛋白减弱与sR_(Xcc)-141体外结合能力 | 第149-151页 |
| 4.5 大肠杆菌hfq基因(hfq_(E.coli))能部分回补Xcc 8004中hfq_(Xcc)缺失引起的表型缺陷 | 第151-154页 |
| 4.6 分析与讨论 | 第154-158页 |
| 4.6.1 关于hfq_(Xcc)的生物学功能 | 第154-155页 |
| 4.6.2 关于Hfq_(Xcc) C端的功能 | 第155-158页 |
| 第五章 Hfq_(Xcc)发挥功能的机理研究 | 第158-205页 |
| 5.1 引言 | 第158页 |
| 5.2 基于RNA-seq技术的转录组分析 | 第158-167页 |
| 5.2.1 培养条件及总RNA的提取 | 第158-159页 |
| 5.2.2 转录组测序的实验流程 | 第159-160页 |
| 5.2.3 测序质量评估 | 第160-163页 |
| 5.2.4 筛选差异表达基因 | 第163页 |
| 5.2.5 差异表达基因的RT-PCR验证 | 第163-164页 |
| 5.2.6 差异表达基因的功能分类 | 第164-165页 |
| 5.2.7 差异表达基因的功能分析 | 第165-167页 |
| 5.3 基于TMT定量标记技术的蛋白组分析 | 第167-182页 |
| 5.3.1 培养条件及总蛋白的提取 | 第167-169页 |
| 5.3.2 定量蛋白组分析的实验流程 | 第169页 |
| 5.3.3 蛋白的鉴定 | 第169-171页 |
| 5.3.4 肽段序列长度分布 | 第171-172页 |
| 5.3.5 重复性分析 | 第172-173页 |
| 5.3.6 差异蛋白统计分析 | 第173-174页 |
| 5.3.7 差异蛋白的功能分类 | 第174-175页 |
| 5.3.8 差异蛋白的Western blotting验证 | 第175-179页 |
| 5.3.9 差异蛋白的Pathway分析 | 第179-180页 |
| 5.3.10 差异蛋白的Pathway富集分析 | 第180-182页 |
| 5.4 Hfq_(Xcc)不影响鞭毛合成相关基因的表达 | 第182-183页 |
| 5.5 Hfq_(Xcc)正调控gum基因簇的转录 | 第183-184页 |
| 5.6 Hfq_(Xcc)对gum基因簇的调控可能是间接调控 | 第184-192页 |
| 5.6.1 Hfq_(Xcc)不能与gumB启动子区直接结合 | 第184-186页 |
| 5.6.2 Hfq_(Xcc)不能与gumB的5'-UTR mRNA直接结合 | 第186-188页 |
| 5.6.3 Hfq_(Xcc)正调控gum基因簇的表达不依赖于Clp蛋白 | 第188-191页 |
| 5.6.4 Hfq_(Xcc)正调控gum基因簇的表达不依赖于rpf基因簇 | 第191-192页 |
| 5.7 Hfq_(Xcc)相互作用蛋白的初步鉴定 | 第192-196页 |
| 5.7.1 Hfq_(Xcc)蛋白的互作网络图 | 第192-193页 |
| 5.7.2 免疫共沉淀(Co-IP) | 第193-194页 |
| 5.7.3 质谱鉴定Co-IP产物 | 第194-195页 |
| 5.7.4 候选互作蛋白的功能分类 | 第195-196页 |
| 5.8 分析与讨论 | 第196-205页 |
| 5.8.1 关于Hfq_(Xcc)的调控元 | 第196-202页 |
| 5.8.2 关于Hfq的作用靶标 | 第202-205页 |
| 第六章 总结 | 第205-208页 |
| 6.1 结论 | 第205-207页 |
| 6.2 展望 | 第207-208页 |
| 参考文献 | 第208-232页 |
| 附录 | 第232-244页 |
| 致谢 | 第244-246页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第246页 |
