| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 主要符号表 | 第15-16页 |
| 第一部分 综述 | 第16-23页 |
| 1.1 蛋白酶简介 | 第16-17页 |
| 1.1.1 中性蛋白酶 | 第16-17页 |
| 1.1.2 噬热菌蛋白酶 | 第17页 |
| 1.2 米曲霉 | 第17-18页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第18-21页 |
| 1.3.2 表达菌株 | 第19-20页 |
| 1.3.3 表达载体 | 第20页 |
| 1.3.4 整合方式 | 第20-21页 |
| 1.3.5 转化方法 | 第21页 |
| 1.3.6 筛选标记 | 第21页 |
| 1.3.7 应用前景 | 第21页 |
| 1.4 本文研究目的及意义 | 第21-23页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第23-42页 |
| 2.1 材料与方法 | 第23-29页 |
| 2.1.1 菌株 | 第23页 |
| 2.1.2 质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.3 培养基 | 第24页 |
| 2.1.3.1 大肠杆菌的培养基配制 | 第24页 |
| 2.1.3.2 酵母培养基的配制 | 第24页 |
| 2.1.3.3 发酵培养基的配制 | 第24页 |
| 2.1.4 药品试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.4.1 酶 | 第24页 |
| 2.1.4.2 试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.4.3 试剂盒 | 第25页 |
| 2.1.5 仪器和设备 | 第25页 |
| 2.1.6 实验主要溶液的配制方法 | 第25-27页 |
| 2.1.6.1 抽提质粒所用的缓冲液 | 第25页 |
| 2.1.6.2 琼脂糖凝胶电泳缓冲液 | 第25-26页 |
| 2.1.6.3 SDS-PAGE溶液 | 第26页 |
| 2.1.6.4 其他溶液的配制 | 第26-27页 |
| 2.1.7 引物 | 第27-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-42页 |
| 2.2.1 PCR扩增NP基因 | 第29-31页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶回收纯化目的DNA片段 | 第31页 |
| 2.2.3 PCR产物的酶切处理 | 第31页 |
| 2.2.4 质粒DNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.4.1 碱裂解法抽提 | 第31-32页 |
| 2.2.4.2 高纯度质粒小纯试剂盒快速提取 | 第32页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.6 大肠杆菌的常规转化及快速转化 | 第33页 |
| 2.2.6.1 大肠杆菌的常规转化 | 第33页 |
| 2.2.6.2 大肠杆菌的快速转化 | 第33页 |
| 2.2.7 表达载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.8 酵母感受态细胞的制备及其转化 | 第34页 |
| 2.2.8.1 毕赤酵母感受态的制备 | 第34页 |
| 2.2.8.2 毕赤酵母电转化法 | 第34页 |
| 2.2.9 重组毕赤酵母的筛选 | 第34-35页 |
| 2.2.10 外源基因在毕赤酵母中的摇瓶表达 | 第35页 |
| 2.2.11 SDS-PAGE检测表达蛋白 | 第35-37页 |
| 2.2.11.1 不同浓度的凝胶成分及配比 | 第35-36页 |
| 2.2.11.2 SDS-PAGE凝胶制备 | 第36页 |
| 2.2.11.3 蛋白样品的制备 | 第36页 |
| 2.2.11.4 电泳 | 第36-37页 |
| 2.2.12 蛋白质浓度的测定 | 第37页 |
| 2.2.13 中性蛋白酶Ⅰ酶活的测定方法 | 第37-39页 |
| 2.2.13.1 中性蛋白酶Ⅰ酶活力的定义 | 第37页 |
| 2.2.13.2 酶活测定原理 | 第37-38页 |
| 2.2.13.3 酶活标准曲线的绘制 | 第38-39页 |
| 2.2.13.4 中性蛋白酶Ⅰ酶活力的测定步骤 | 第39页 |
| 2.2.13.5 中性蛋白酶Ⅰ酶活力计算 | 第39页 |
| 2.2.14 外源基因在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达 | 第39-40页 |
| 2.2.15 中性蛋白酶Ⅰ酶学性质的研究 | 第40-42页 |
| 2.2.15.1 最适反应温度的测定 | 第40页 |
| 2.2.15.2 最适反应pH的测定 | 第40-41页 |
| 2.2.15.3 热稳定性的测定 | 第41页 |
| 2.2.15.4 各种添加剂对中性蛋白酶酶活的影响 | 第41-42页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第42-53页 |
| 3.1 中性蛋白酶NPI基因密码子的合成 | 第42-43页 |
| 3.2 蛋白酶毕赤酵母表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 3.3 pHBM905BDM-NPI的毕赤酵母转化及转化子的鉴定 | 第44-45页 |
| 3.4 米曲霉来源中性蛋白酶在毕赤酵母中的表达 | 第45-46页 |
| 3.5 NPI的纯化 | 第46-47页 |
| 3.6 中性蛋白酶NPI酶学性质分析 | 第47-51页 |
| 3.6.1 温度及pH对NPI活性的影响 | 第47-48页 |
| 3.6.1.1 NPI最适温度的测定 | 第47页 |
| 3.6.1.2 NPI最适pH的测定 | 第47页 |
| 3.6.1.3 NPI热稳定性的测定 | 第47-48页 |
| 3.6.2 不同添加剂对NPI活性的影响 | 第48-51页 |
| 3.6.2.1 1 mM的不同离子和变性剂对NPI活性的影响 | 第48-49页 |
| 3.6.2.2 Zn~(2+)对NPI酶活影响 | 第49-50页 |
| 3.6.2.3 Ca~(2+)和Mg~(2+)对NPI酶活影响 | 第50页 |
| 3.6.2.4 Ca~(2+)和Mg~(2+)对NPI热稳定性影响 | 第50-51页 |
| 3.7 NPI的高密度发酵 | 第51-53页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第53-54页 |
| 4.1 讨论 | 第53页 |
| 4.2 展望 | 第53-54页 |
| 第五部分 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
