| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-23页 |
| 1 金鱼鳃形态可逆性重塑 | 第15-17页 |
| 1.1 金鱼鳃部结构简介 | 第15页 |
| 1.2 金鱼鳃形态变化 | 第15-16页 |
| 1.3 低氧诱导因子 | 第16-17页 |
| 2 凋亡调节蛋白Bim结构及功能 | 第17-18页 |
| 3 miR-24 | 第18-19页 |
| 4 热休克蛋白HSC70和HSP40 | 第19-20页 |
| 5 ERK信号通路和ERK抑制剂 | 第20-22页 |
| 6 研究的目的及意义 | 第22-23页 |
| 第二章 金鱼Bim基因克隆和抗体的制备 | 第23-42页 |
| 1 实验材料 | 第23-25页 |
| 1.1 主要材料 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂 | 第23页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第23-24页 |
| 1.4 实验仪器 | 第24-25页 |
| 2 试验方法 | 第25-33页 |
| 2.1 金鱼鳃组织总RNA的提取与RT-PCR | 第25-26页 |
| 2.1.1 Trizol法提取金鱼总RNA | 第25-26页 |
| 2.1.2 cDNA—链合成 | 第26页 |
| 2.2 金鱼Bim基因CDS区序列克隆 | 第26-31页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第26-27页 |
| 2.2.2 金鱼Bim CDS区PCR扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.3 割胶回收 | 第28页 |
| 2.2.4 目的片段连接pMD19-T克隆载体 | 第28-29页 |
| 2.2.5 DH5α大肠杆菌感受态制备 | 第29页 |
| 2.2.6 转化 | 第29-30页 |
| 2.2.7 克隆载体菌液验证 | 第30页 |
| 2.2.8 质粒提取 | 第30-31页 |
| 2.3 金鱼Bim基因3'-UTR序列克隆 | 第31-33页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.3.2 cDNA—链合成 | 第32页 |
| 2.3.3 序列扩增 | 第32页 |
| 2.3.4 割胶回收 | 第32页 |
| 2.3.5 pGEM-T-Bim-3'-UTR克隆载体构建 | 第32-33页 |
| 2.4 Bim抗体制备 | 第33页 |
| 3 实验结果 | 第33-40页 |
| 3.1 金鱼鳃组织总RNA提取 | 第33页 |
| 3.2 金鱼Bim基因CDS区序列克隆 | 第33-37页 |
| 3.2.1 Bim CDS序列扩增 | 第33-34页 |
| 3.2.2 Bim-pMD 19T克隆载体构建 | 第34-35页 |
| 3.2.3 Bim CDS序列分析 | 第35-37页 |
| 3.3 Bim 3'-UTR序列克隆 | 第37-38页 |
| 3.3.1 3'RACE PCR | 第37页 |
| 3.3.2 pGEM-T Bim 3'-UTR克隆载体构建 | 第37-38页 |
| 3.3.3 Bim 3'-UTR序列 | 第38页 |
| 3.4 Bim基因抗体制备 | 第38-40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 miR-24及Bim在金鱼低氧适应中的差异性表达分析 | 第42-56页 |
| 1 实验材料 | 第42-44页 |
| 1.1 材料 | 第42页 |
| 1.2 主要实验试剂 | 第42-43页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第43-44页 |
| 1.4 主要仪器 | 第44页 |
| 2 实验方法 | 第44-52页 |
| 2.1 荧光定量PCR引物设计 | 第44-45页 |
| 2.2 动物处理 | 第45-46页 |
| 2.2.1 药物注射 | 第45页 |
| 2.2.2 低氧处理与组织取材 | 第45-46页 |
| 2.3 金鱼鳃组织总RNA提取与RT-PCR | 第46-48页 |
| 2.3.1 Trizol法提取金鱼总RNA | 第46页 |
| 2.3.2 cDNA—链合成 | 第46-48页 |
| 2.4 Bim和miR-24荧光定量PCR | 第48-49页 |
| 2.5 金鱼鳃形态观察 | 第49页 |
| 2.6 Western Blot实验 | 第49-52页 |
| 2.6.1 RIPA法提取蛋白质 | 第49页 |
| 2.6.2 蛋白定量及变性 | 第49-50页 |
| 2.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第50-51页 |
| 2.6.4 转膜(半干法) | 第51页 |
| 2.6.5 免疫反应 | 第51-52页 |
| 3 实验结果 | 第52-55页 |
| 3.1 金鱼鳃组织总RNA提取与RT-PCR | 第52-53页 |
| 3.1.1 RNA提取 | 第52页 |
| 3.1.2 反转录cDNA的Actin基因验证 | 第52-53页 |
| 3.2 Bim和miR-24荧光定量PCR | 第53页 |
| 3.3 金鱼鳃组织图片观察 | 第53-54页 |
| 3.4 Western Blot实验结果 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 第四章 金鱼温度胁迫中Bim表达分析及RNA Pull-down分析 | 第56-75页 |
| 1 实验材料 | 第56-59页 |
| 1.1 主要材料 | 第56页 |
| 1.2 主要试剂 | 第56-57页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第57-58页 |
| 1.4 主要仪器 | 第58-59页 |
| 2 试验方法 | 第59-68页 |
| 2.1 动物处理 | 第59页 |
| 2.2 金鱼鳃组织总RNA的提取与RT-PCR | 第59-60页 |
| 2.2.1 Trizol法提取金鱼总RNA | 第59页 |
| 2.2.2 cDNA—链合成 | 第59-60页 |
| 2.3 Bim基因荧光定量PCR和蛋白表达分析 | 第60-61页 |
| 2.3.1 荧光定量PCR | 第60-61页 |
| 2.3.2 蛋白表达分析 | 第61页 |
| 2.4 金鱼HSC70、 HSP40基因克隆 | 第61-63页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第61-62页 |
| 2.4.2 金鱼HSC70、HSP40 CDS区PCR扩增 | 第62-63页 |
| 2.5 HSC70、HSP40基因原核表达 | 第63-64页 |
| 2.5.1 原核表达载体构建 | 第63-64页 |
| 2.5.2 原核诱导表达 | 第64页 |
| 2.6 HSC70、 HSP40蛋白纯化 | 第64-66页 |
| 2.6.1 蛋白纯化 | 第64-65页 |
| 2.6.2 Western Blot实验检测纯化蛋白 | 第65-66页 |
| 2.7 Bim 3'-UTR RNA pull-down实验 | 第66-68页 |
| 2.7.1 pGEM-T Bim-3'-UTR单酶切 | 第66页 |
| 2.7.2 体外转录和生物素标记 | 第66-67页 |
| 2.7.3 RNA与蛋白互作 | 第67-68页 |
| 3 实验结果 | 第68-74页 |
| 3.1 金鱼鳃组织总RNA提取 | 第68页 |
| 3.2 Bim基因荧光定量PCR和蛋白表达分析 | 第68-69页 |
| 3.2.1 荧光定量PCR | 第68-69页 |
| 3.2.2 蛋白表达分析 | 第69页 |
| 3.3 HSC70、HSP40基因克隆 | 第69-71页 |
| 3.3.1 PCR扩增序列 | 第69-70页 |
| 3.3.2 克隆载体构建 | 第70-71页 |
| 3.4 HSC70、HSP40基因原核表达 | 第71-73页 |
| 3.4.1 原核表达载体构建 | 第71-72页 |
| 3.4.2 原核诱导表达 | 第72-73页 |
| 3.5 Bim 3'-UTR RNA pull-down实验 | 第73-74页 |
| 3.5.1 pGEM-T-Bim-3'-UTR单酶切 | 第73页 |
| 3.5.2 RNA Pull-down | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74-75页 |
| 结果与展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 缩略语 | 第81-82页 |
| 致谢词 | 第82-83页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第83-85页 |
