| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-21页 |
| 1.1 猪圆环病毒的防治 | 第9-11页 |
| 1.2 国内外研究现状 | 第11-15页 |
| 1.2.1 猪圆环病毒的病原学历史 | 第11-13页 |
| 1.2.2 PCV2的基因组研究 | 第13-14页 |
| 1.2.3 PCV2病毒核衣壳蛋白质(Cap)蛋白的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.2.4 Cap蛋白组装体(capsid)的研究进展 | 第15页 |
| 1.3 PCV1与PCV2在五倍轴的差异 | 第15-18页 |
| 1.3.1 LoopBC上的抗原表位 | 第17页 |
| 1.3.2 PCV2的capsid表面五倍轴loops的相互作用 | 第17-18页 |
| 1.4 分子生物学以及蛋白组学检测方法研究进展 | 第18-20页 |
| 1.4.1 PCR检测技术 | 第18页 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR | 第18-19页 |
| 1.4.3 间接免疫荧光技术 | 第19页 |
| 1.4.4 病毒感染性DNA克隆 | 第19页 |
| 1.4.5 质粒转染 | 第19-20页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第20-21页 |
| 第二章 PCV2的Cap蛋白LoopBC突变体的构建与原核表达 | 第21-34页 |
| 2.1 试验材料与仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第21页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 | 第22页 |
| 2.2 Cap蛋白差异性比对 | 第22-23页 |
| 2.2.1 PCV1与PCV2的氨基酸序列比对 | 第22-23页 |
| 2.2.2 PCV2的Cap与突变体Cap的3D蛋白结构比对 | 第23页 |
| 2.3 PCV2Cap突变体蛋白的质粒构建 | 第23-27页 |
| 2.3.1 Overlap-PCR的引物设计 | 第23-24页 |
| 2.3.2 PCR与overlap-PCR扩增 | 第24页 |
| 2.3.3 PCR产物回收并纯化 | 第24-25页 |
| 2.3.4 双酶切胶回收产物 | 第25页 |
| 2.3.5 胶回收产物的普通回收 | 第25-26页 |
| 2.3.6 载体与片段的连接反应 | 第26页 |
| 2.3.7 连接产物转化 | 第26-27页 |
| 2.3.8 质粒提取 | 第27页 |
| 2.4 野生型Cap以及Cap突变体蛋白的原核表达 | 第27-29页 |
| 2.4.1 质粒转化 | 第27-28页 |
| 2.4.2 突变体蛋白可溶性分析的检测 | 第28页 |
| 2.4.3 Cap蛋白以及Cap突变体蛋白的纯化 | 第28-29页 |
| 2.4.4 纯化后蛋白的鉴定 | 第29页 |
| 2.5 结果与分析 | 第29-32页 |
| 2.5.1 PCV1与PCV2的在LoopBC区域的氨基酸序列比对 | 第29-30页 |
| 2.5.2 PCV2Cap蛋白突变体的3D结构模拟 | 第30页 |
| 2.5.3 ORF2基因的扩增以及酶切鉴定与测序结果分析 | 第30-31页 |
| 2.5.4 蛋白的可溶性分析 | 第31-32页 |
| 2.5.5 蛋白的纯化与鉴定 | 第32页 |
| 2.6 讨论 | 第32-34页 |
| 第三章 Cap蛋白及其突变体VLPs的制备与感染性克隆DNA的构建 | 第34-50页 |
| 3.1 试验材料与仪器 | 第34-35页 |
| 3.1.1 试验材料 | 第34页 |
| 3.1.2 主要实验设备 | 第34-35页 |
| 3.2 Cap蛋白及其突变体VLPs的组装 | 第35-36页 |
| 3.2.1 Cap蛋白的体外组装 | 第35页 |
| 3.2.2 色谱法检测VLPs的颗粒大小 | 第35-36页 |
| 3.2.3 硫酸乙酰肝素纯化野生型与突变型VLPs | 第36页 |
| 3.3 VLPs侵染PK-15细胞 | 第36-37页 |
| 3.3.1 复苏PK-15细胞 | 第36-37页 |
| 3.3.2 测量Cap蛋白浓度 | 第37页 |
| 3.3.3 IFA法检测突变体Cap蛋白内化PK-15细胞 | 第37页 |
| 3.4 PCV2感染性克隆以及突变型感染性克隆DNA的构建 | 第37-39页 |
| 3.4.1 OverlapPCR扩增反应 | 第37-38页 |
| 3.4.2 双酶切PCR产物 | 第38-39页 |
| 3.4.3 连接产物的测序 | 第39页 |
| 3.5 野生型与突变型感染性克隆DNA的质粒大提 | 第39-40页 |
| 3.5.1 质粒DNA的大量扩增 | 第39页 |
| 3.5.2 质粒大提 | 第39-40页 |
| 3.6 质粒转染以及PK-15细胞内病毒拷贝数的检测 | 第40-42页 |
| 3.6.1 质粒转染 | 第40-41页 |
| 3.6.2 FQ-PCR检测PCV2病毒载量 | 第41-42页 |
| 3.6.3 PK-15细胞内病毒的IFA染色 | 第42页 |
| 3.7 PCV2感染性DNA克隆转染至PK-15细胞后的测序 | 第42-44页 |
| 3.7.1 PK-15细胞的DNA提取 | 第42-43页 |
| 3.7.2 PK-15细胞的DNA检测 | 第43页 |
| 3.7.3 PK-15细胞的DNA检测 | 第43-44页 |
| 3.8 结果与分析 | 第44-48页 |
| 3.8.1 蛋白组装结果 | 第44-45页 |
| 3.8.2 VLPs的纯化与分子筛结果 | 第45页 |
| 3.8.3 VLPs通过肝素填料纯化后的分析 | 第45-46页 |
| 3.8.4 VLPs内化入PK-15细胞的间接免疫荧光(IFA)验证 | 第46页 |
| 3.8.5 感染性克隆转染PK-15细胞后的Q-PCR结果 | 第46-47页 |
| 3.8.6 转染感染性克隆后的PK-15细胞IFA检测 | 第47-48页 |
| 3.9 讨论 | 第48-50页 |
| 第四章 结论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-59页 |
| 附录Ⅰ | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 作者简介 | 第61页 |
