| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-38页 |
| 1.1 “自上而下”基因组简化 | 第14-15页 |
| 1.2 “自下而上”基因组合成 | 第15-21页 |
| 1.2.1 “设计-构建-检验-纠错-学习”循环式基因组合成策略 | 第15-16页 |
| 1.2.2 基因组合成标志性成果 | 第16-20页 |
| 1.2.3 人工合成酿酒酵母基因组 | 第20-21页 |
| 1.3 合成型基因组的设计 | 第21-28页 |
| 1.3.1 功能存活性 | 第21-22页 |
| 1.3.2 遗传稳定性 | 第22-23页 |
| 1.3.3 操作柔性 | 第23-28页 |
| 1.3.4 计算机辅助设计 | 第28页 |
| 1.4 合成型基因组的构建 | 第28-32页 |
| 1.4.1 DNA合成技术 | 第29-30页 |
| 1.4.2 基因组构建 | 第30-32页 |
| 1.5 合成型基因组的检验 | 第32-33页 |
| 1.6 合成型基因组的纠错 | 第33-34页 |
| 1.7 研究意义与内容 | 第34-38页 |
| 1.7.1 研究意义 | 第34-35页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第35-38页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第38-56页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第38-44页 |
| 2.1.1 基因操作试剂 | 第38页 |
| 2.1.2 培养基配制试剂 | 第38-39页 |
| 2.1.3 菌株、质粒与引物 | 第39-44页 |
| 2.2 生长适应性验证培养基 | 第44-45页 |
| 2.3 溶液 | 第45页 |
| 2.4 主要基因操作方法 | 第45-56页 |
| 2.4.1 重叠延伸PCR | 第45-46页 |
| 2.4.2 染色体迭代替换 | 第46页 |
| 2.4.3 酵母基因组DNA提取 | 第46-47页 |
| 2.4.4 PCRTag检测分析 | 第47-48页 |
| 2.4.5 酵母菌落PCR | 第48页 |
| 2.4.6 随机孢子分析 | 第48-49页 |
| 2.4.7 核内倍增回交 | 第49-50页 |
| 2.4.8 URA3筛选标记的敲除和5-FOA筛选 | 第50页 |
| 2.4.9 半乳糖诱导GAL启动子表达 | 第50-51页 |
| 2.4.10 酵母交配型验证 | 第51页 |
| 2.4.11 酵母质粒丢失 | 第51页 |
| 2.4.12 酵母RNA提取 | 第51-52页 |
| 2.4.13 脉冲场电泳样品制备 | 第52-53页 |
| 2.4.14 反向PCR | 第53页 |
| 2.4.15 CRISPR质粒构建 | 第53-55页 |
| 2.4.16 CRISPR/Cas9介导的整合型共转化靶点修复 | 第55-56页 |
| 第3章 合成型酿酒酵母V号染色体的设计与构建 | 第56-68页 |
| 3.1 SYNV设计与命名 | 第56-57页 |
| 3.1.1 SynV设计 | 第56页 |
| 3.1.2 SynV命名法则 | 第56-57页 |
| 3.2 SYNVDNA片段合成 | 第57-59页 |
| 3.2.1 Buildingblock的合成 | 第57-58页 |
| 3.2.2 Minichunk组装 | 第58-59页 |
| 3.3 迭代替换构建SYNV | 第59-61页 |
| 3.4 基于减数分裂同源重组构建SYNV | 第61-63页 |
| 3.5 人工端粒替换天然端粒以及亚端粒区域的删除 | 第63-65页 |
| 3.5.1 SynV右侧人工端粒替换 | 第63-64页 |
| 3.5.2 SynV左侧人工端粒替换 | 第64-65页 |
| 3.6 讨论 | 第65-66页 |
| 3.7 小结 | 第66-68页 |
| 第4章 合成型V号染色体表征 | 第68-80页 |
| 4.1 PCRTAG分析 | 第68-70页 |
| 4.2 高通量QPCRTAG筛选 | 第70-71页 |
| 4.3 脉冲场电泳检测 | 第71页 |
| 4.4 全基因组测序 | 第71-72页 |
| 4.5 中间菌株生长表型 | 第72-74页 |
| 4.6 生长曲线分析 | 第74-75页 |
| 4.7 细胞形态分析 | 第75-76页 |
| 4.8 SYNV菌落形态和生长适应性分析 | 第76-78页 |
| 4.9 SYNV菌株转录组分析 | 第78-79页 |
| 4.10 讨论 | 第79页 |
| 4.11 小结 | 第79-80页 |
| 第5章 合成型V号染色体修复与再设计 | 第80-98页 |
| 5.1 基于酿酒酵母PCRTAG的缺陷靶点快速定位与修复 | 第80页 |
| 5.2 生长适应性缺陷原因探究 | 第80-86页 |
| 5.2.1 tRNA基因移除 | 第80-81页 |
| 5.2.2 基于酿酒酵母PCRTag的缺陷靶点快速定位 | 第81-84页 |
| 5.2.3 YEL027W&028W再设计与修复 | 第84-86页 |
| 5.3 反向PCR分析YEL070W1野生型PCRTAG扩增子 | 第86-87页 |
| 5.4 YER118C1合成型PCRTAG引物再设计 | 第87-89页 |
| 5.5 核内倍增回交修复DNA大片段重复 | 第89-90页 |
| 5.6 DNA四倍重复区域的确认与修复 | 第90-94页 |
| 5.6.1 PCR分析确认重复区域结构特征 | 第90页 |
| 5.6.2 qPCR分析确认DNA重复拷贝数 | 第90-92页 |
| 5.6.3 DNA四倍重复区域的修复 | 第92-94页 |
| 5.7 TAG终止密码子设计缺陷与再设计 | 第94-95页 |
| 5.8 讨论 | 第95页 |
| 5.9 小结 | 第95-98页 |
| 第6章 “完美”V号染色体构建 | 第98-118页 |
| 6.1 错误靶点区域划分 | 第98-99页 |
| 6.2 错误靶点DNA修复片段的构建 | 第99-100页 |
| 6.3 筛选标记的构建 | 第100-103页 |
| 6.4 错误靶点修复验证 | 第103-106页 |
| 6.4.1 位点特异性PCR验证 | 第103-105页 |
| 6.4.2 酶切验证 | 第105页 |
| 6.4.3 Sanger测序验证 | 第105-106页 |
| 6.5 错误靶点1修复 | 第106-108页 |
| 6.5.1 错误靶点1确认 | 第106-107页 |
| 6.5.2 错误靶点1修复 | 第107-108页 |
| 6.6 整合型多靶点共转化修复策略 | 第108-110页 |
| 6.7 CRISPR/CAS9介导的多靶点共转化修复 | 第110-113页 |
| 6.7.1 错误靶点前引导序列和PAM | 第112页 |
| 6.7.2 CRISPR/Cas9介导的多靶点共转化修复策略 | 第112-113页 |
| 6.8 CRISPR/CAS9介导的整合型多靶点共转化修复策略 | 第113-116页 |
| 6.8.1 双筛选标记KanMX4?HIS3的构建 | 第114页 |
| 6.8.2 CRISPR/Cas9介导的整合型多靶点共转化修复策略 | 第114-116页 |
| 6.9 讨论 | 第116-117页 |
| 6.10 小结 | 第117-118页 |
| 第7章 酿酒酵母环形染色体设计与构建 | 第118-134页 |
| 7.1 基于酿酒酵母同源重组构建环形染色体 | 第118-119页 |
| 7.2 CRISPR/CAS9介导的酿酒酵母染色体环化 | 第119-126页 |
| 7.2.1 带有筛选标记的环形染色体构建 | 第122-123页 |
| 7.2.2 无筛选标记的环形染色体构建 | 第123-126页 |
| 7.3 RING_SYNV生长适应性分析 | 第126页 |
| 7.4 RING_WTV生长适应性分析 | 第126-128页 |
| 7.5 RING_SYNV转录组分析 | 第128页 |
| 7.6 脉冲场稳定性分析 | 第128-130页 |
| 7.7 环形V号染色体减数分裂稳定性分析 | 第130页 |
| 7.8 结论 | 第130-131页 |
| 7.9 小结 | 第131-134页 |
| 第8章 结论与展望 | 第134-136页 |
| 8.1 研究总结 | 第134-135页 |
| 8.2 展望 | 第135-136页 |
| 参考文献 | 第136-146页 |
| 附录A | 第146-166页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第166-168页 |
| 致谢 | 第168-169页 |
