| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第14-38页 |
| 1.1 植物细胞全能性与形态发生 | 第14-16页 |
| 1.1.1 植物细胞全能性概述 | 第15页 |
| 1.1.2 植物细胞离体培养下脱分化 | 第15-16页 |
| 1.1.3 离体组织器官发生 | 第16页 |
| 1.1.4 体细胞胚胎发生 | 第16页 |
| 1.2 植物组织培养体系中的内源和外源影响因子 | 第16-19页 |
| 1.2.1 内源影响因子 | 第17-18页 |
| 1.2.1.1 基因型 | 第17页 |
| 1.2.1.2 母体植株的生理状态 | 第17页 |
| 1.2.1.3 母体植株的生长环境 | 第17-18页 |
| 1.2.2 外源影响因子 | 第18-19页 |
| 1.2.2.1 植物激素 | 第18页 |
| 1.2.2.2 营养因子 | 第18-19页 |
| 1.3 油菜再生体系研究进展 | 第19-25页 |
| 1.3.1 影响油菜愈伤诱导和植株再生的因素 | 第19-22页 |
| 1.3.1.1 基因型 | 第19-20页 |
| 1.3.1.2 外植体 | 第20-21页 |
| 1.3.1.3 激素 | 第21页 |
| 1.3.1.4 培养条件 | 第21-22页 |
| 1.3.2 油菜组织培养再生过程中遇到的问题和应对措施 | 第22-25页 |
| 1.3.2.1 外植体褐化现象 | 第22-24页 |
| 1.3.2.2 外植体玻璃化 | 第24-25页 |
| 1.4 植物叶绿体基因工程研究进展 | 第25-38页 |
| 1.4.1 叶绿体基因工程原理 | 第25-29页 |
| 1.4.2 叶绿体中外源基因的整合与调控 | 第29-31页 |
| 1.4.2.1 同源重组片段 | 第29页 |
| 1.4.2.2 启动子和非翻译区 | 第29-30页 |
| 1.4.2.3 外源基因的积累和基因表达调控 | 第30-31页 |
| 1.4.3 叶绿体转基因材料的筛选 | 第31-34页 |
| 1.4.3.1 抗生素筛选标记基因 | 第31-32页 |
| 1.4.3.2 其它筛选标记基因 | 第32-33页 |
| 1.4.3.3 标记基因的去除 | 第33页 |
| 1.4.3.4 叶绿体转化植株同质化问题 | 第33-34页 |
| 1.4.4 叶绿体基因工程的应用 | 第34-37页 |
| 1.4.4.1 生物反应器 | 第34-35页 |
| 1.4.4.2 改良农艺性状 | 第35-36页 |
| 1.4.4.3 叶绿体转化技术在基础研究方面的应用 | 第36-37页 |
| 1.4.5 我国植物叶绿体基因工程研究现状 | 第37-38页 |
| 2 研究目的和意义 | 第38-39页 |
| 3 适合油菜叶绿体转化的再生体系的建立 | 第39-50页 |
| 3.1 材料与方法 | 第39-43页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第39页 |
| 3.1.1.1 油菜材料 | 第39页 |
| 3.1.1.2 主要生化试剂 | 第39页 |
| 3.1.1.3 主要仪器设备 | 第39页 |
| 3.1.2 主要试剂和培养基配制 | 第39-41页 |
| 3.1.2.1 主要试剂配制 | 第39-40页 |
| 3.1.2.2 培养基配制 | 第40-41页 |
| 3.1.3 实验方法 | 第41-42页 |
| 3.1.3.1 技术路线 | 第41页 |
| 3.1.3.2 不同灭菌剂对无菌苗生长的影响 | 第41-42页 |
| 3.1.3 无菌苗种植 | 第42页 |
| 3.1.3.4 子叶和叶片愈伤组织的诱导 | 第42页 |
| 3.1.3.5 子叶和叶片愈伤组织的分化培养 | 第42页 |
| 3.1.3.6 再生苗的壮苗、春化、移栽 | 第42页 |
| 3.1.4 结果统计 | 第42-43页 |
| 3.2 结果与分析 | 第43-50页 |
| 3.2.1 不同灭菌剂对油菜无菌苗的影响 | 第43页 |
| 3.2.2 不同植物激素对愈伤组织诱导的影响 | 第43-45页 |
| 3.2.2.1 不同激素配比对子叶外植体愈伤组织诱导的差异 | 第43-45页 |
| 3.2.2.2 不同激素配比对叶片外植体愈伤组织诱导的差异 | 第45页 |
| 3.2.3 光照和黑暗条件下子叶愈伤组织的差异 | 第45-47页 |
| 3.2.4 不同植物激素对油菜愈伤组织保持脱分化状态的影响 | 第47页 |
| 3.2.5 不同植物激素配比对愈伤组织分化的影响 | 第47-48页 |
| 3.2.6 愈伤组织培养时间对分化率的影响 | 第48-50页 |
| 4 适合上述组织培养体系的品种的筛选 | 第50-55页 |
| 4.1 材料与方法 | 第50-51页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第50页 |
| 4.1.1.1 油菜材料 | 第50页 |
| 4.1.1.2 主要生化试剂和培养基 | 第50页 |
| 4.1.1.3 主要仪器设备 | 第50页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第50-51页 |
| 4.1.2.1 无菌苗种植及叶片外植体的获得 | 第50-51页 |
| 4.1.2.2 愈伤组织诱导 | 第51页 |
| 4.1.2.3 诱导愈伤组织分化 | 第51页 |
| 4.1.2.4 再生苗的壮苗、春化和移栽 | 第51页 |
| 4.1.3 结果统计 | 第51页 |
| 4.2 结果与分析 | 第51-55页 |
| 4.2.1 FY系列油菜不同品种间再生频率差异 | 第51-52页 |
| 4.2.2 T系列油菜不同品种间再生频率差异 | 第52-53页 |
| 4.2.3 不同状态的愈伤组织比较 | 第53页 |
| 4.2.4 形态异常再生小苗 | 第53-55页 |
| 5 油菜品种特异性叶绿体表达载体的构建 | 第55-75页 |
| 5.1 材料与方法 | 第55-63页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第55页 |
| 5.1.1.1 细菌菌株及质粒 | 第55页 |
| 5.1.1.2 溶液、酶和试剂盒 | 第55页 |
| 5.1.1.3 主要仪器设备 | 第55页 |
| 5.1.2 常用试剂配制和培养基配制 | 第55-59页 |
| 5.1.2.1 常用试剂配制 | 第55-56页 |
| 5.1.2.2 质粒提取试剂 | 第56-57页 |
| 5.1.2.3 油菜叶绿体基因组DNA提取试剂 | 第57页 |
| 5.1.2.4 细菌培养所用培养基 | 第57-58页 |
| 5.1.2.5 所用引物 | 第58-59页 |
| 5.1.3 实验方法 | 第59-63页 |
| 5.1.3.1 提取质粒DNA | 第59-61页 |
| 5.1.3.2 感受态细胞的制备及转化 | 第61-63页 |
| 5.1.3.3 PCR克隆基因 | 第63页 |
| 5.2 结果与分析 | 第63-75页 |
| 5.2.1 同源重组片段的克隆与分析 | 第63-65页 |
| 5.2.1.1 FY-4来源1.5 kb的同源片段tmI/tmA克隆 | 第63-64页 |
| 5.21.2 FY-4来源2.5 kb同源片段16S/tmI和tmA/23S克隆 | 第64页 |
| 5.2.1.3 T13来源1.5 kb同源片段rbcL/accD的克隆 | 第64-65页 |
| 5.2.2 调控原件克隆 | 第65-66页 |
| 5.2.2.1 叶绿体特异性启动子Prrn和终止子TpsbA克隆 | 第65-66页 |
| 5.2.2.2 T7 g10L和gfp部分序列的SOE-PCR克隆 | 第66页 |
| 5.2.3 相关基因的克隆与分析 | 第66-67页 |
| 5.2.3.1 筛选标记基因aadA的克隆 | 第66页 |
| 5.2.3.2 人血清白蛋白基因HSA克隆 | 第66-67页 |
| 5.2.4 不同构建形式的油菜品种特异性转化载体的构建 | 第67-75页 |
| 5.2.4.1 pCL318-5转化载体的构建 | 第67-70页 |
| 5.2.4.2 pCL1013-8转化载体的构建 | 第70页 |
| 5.2.4.3 pCL1031-F4转化载体的构建 | 第70-75页 |
| 6 基因枪介导的油菜叶绿体转化体系的研究 | 第75-103页 |
| 6.1 材料与方法 | 第75-88页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第75页 |
| 6.1.1.1 油菜材料 | 第75页 |
| 6.1.1.2 质粒DNA | 第75页 |
| 6.1.1.3 主要生化试剂 | 第75页 |
| 6.1.1.4 主要仪器设备 | 第75页 |
| 6.1.2 培养基和主要试剂配制 | 第75-78页 |
| 6.1.2.1 油菜叶绿体转化及筛选所需培养基 | 第75页 |
| 6.1.2.2 基因枪轰击相关试剂 | 第75-76页 |
| 6.1.2.3 油菜基因组DNA提取试剂 | 第76-77页 |
| 6.1.2.4 Southern杂交相关试剂 | 第77-78页 |
| 6.1.2.5 Northern杂交相关试剂 | 第78页 |
| 6.1.3 实验方法 | 第78-88页 |
| 6.1.3.1 油菜无菌苗的获得 | 第78-79页 |
| 6.1.3.2 子叶或叶片的高渗培养 | 第79页 |
| 6.1.3.3 基因枪轰击油菜子叶(只轰击金粉)实验 | 第79页 |
| 6.1.3.4 基因枪转化油菜子叶或叶片 | 第79-80页 |
| 6.1.3.5 转化后子叶或叶片的恢复培养 | 第80页 |
| 6.1.3.6 子叶或叶片外植体愈伤组织诱导及筛选 | 第80页 |
| 6.1.3.7 愈伤组织分化筛选 | 第80-81页 |
| 6.1.3.8 FY-4和T15绿色抗性苗的生根、壮苗、春化和移栽 | 第81页 |
| 6.1.3.9 CTAB法提取油菜基因组DNA | 第81-82页 |
| 6.1.3.10 不同引物PCR鉴定抗性苗 | 第82页 |
| 6.1.3.11 Southern杂交分析 | 第82-85页 |
| 6.1.3.12 油菜总RNA的提取 | 第85-86页 |
| 6.1.3.13 Northern杂交分析 | 第86-88页 |
| 6.1.3.14 FY-4叶绿体转基因植株的后代鉴定 | 第88页 |
| 6.1.4 结果统计 | 第88页 |
| 6.2 结果与分析 | 第88-103页 |
| 6.2.1 基因枪轰击/不轰击对叶片外植体的损伤分析 | 第88-90页 |
| 6.2.2 以油菜FY-4子叶为外植体的叶绿体转化植株的获得及鉴定 | 第90-97页 |
| 6.2.2.1 基因枪轰击子叶外植体、筛选及转化植株的获得 | 第90-91页 |
| 6.2.2.2 筛选过程中出现的嵌合体小苗 | 第91-92页 |
| 6.2.2.3 FY-4叶绿体转基因植株T0代PCR鉴定 | 第92-93页 |
| 6.2.2.4 FY-4阳性植株不同探针的Southern杂交鉴定 | 第93-94页 |
| 6.2.2.5 FY-4 Southern杂交阳性植株的Northern杂交鉴定 | 第94-95页 |
| 6.2.2.6 FY-4转基因植株的后代鉴定 | 第95-97页 |
| 6.2.3 以叶片为外植体的T15油菜品种叶绿体转化植株的获得 | 第97-99页 |
| 6.2.3.1 基因枪轰击T15叶片、筛选及转化植株的获得 | 第97-99页 |
| 6.2.3.2 T15叶绿体转基因植株T0代PCR鉴定 | 第99页 |
| 6.2.4 不同筛选方法对外植体筛选及转化的的影响 | 第99-101页 |
| 6.2.4.1 不同筛选方法对外植体出愈率、褐化率和白化率的影响 | 第99-100页 |
| 6.2.4.2 不同筛选方案得到的绿色愈伤数和阳性苗数比较 | 第100-101页 |
| 6.2.5 不同长度同源片段及不同构建形式的转化载体对转化的影响 | 第101-102页 |
| 6.2.6 绿色抗性苗的再次脱分化筛选 | 第102-103页 |
| 7 讨论 | 第103-109页 |
| 7.1 适合油菜叶绿体转化的组织培养体系的建立 | 第103-105页 |
| 7.2 油菜品种特异性叶绿体转化载体的构建 | 第105-106页 |
| 7.3 油菜叶绿体转基因植株的获得 | 第106-107页 |
| 7.4 叶绿体转基因植株的分子鉴定 | 第107-109页 |
| 8 参考文献 | 第109-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 附录 | 第123页 |
