| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-12页 |
| 1 引言 | 第12-24页 |
| 1.1 PEDV 概述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 PEDV 的形态结构 | 第12-13页 |
| 1.1.2 PEDV 的理化特性 | 第13页 |
| 1.1.3 PEDV 的培养特性 | 第13页 |
| 1.2 PEDV 基因组结构及主要编码的蛋白 | 第13-17页 |
| 1.2.1 PEDV 的基因组结构 | 第13-14页 |
| 1.2.2 主要编码的蛋白 | 第14-17页 |
| 1.3 免疫原性研究 | 第17-18页 |
| 1.3.1 体液免疫 | 第17页 |
| 1.3.2 细胞免疫 | 第17-18页 |
| 1.4 PED 流行病学、临诊症状和发病机理 | 第18页 |
| 1.4.1 PED 流行病学 | 第18页 |
| 1.4.2 临诊症状 | 第18页 |
| 1.4.3 主要发病机理 | 第18页 |
| 1.5 疫苗研究进展 | 第18-20页 |
| 1.5.1 组织灭活苗 | 第18-19页 |
| 1.5.2 细胞灭活苗 | 第19页 |
| 1.5.3 细胞弱毒苗 | 第19页 |
| 1.5.4 高免血清 | 第19页 |
| 1.5.5 转基因植物疫苗 | 第19-20页 |
| 1.6 PEDV 诊断技术 | 第20-22页 |
| 1.6.1 免疫电镜法(IEM) | 第20页 |
| 1.6.2 免疫荧光法(IF) | 第20页 |
| 1.6.3 间接血凝试验(IHA) | 第20-21页 |
| 1.6.4 微量血清中和试验 | 第21页 |
| 1.6.5 RT-PCR 法 | 第21页 |
| 1.6.6 ELISA 法 | 第21-22页 |
| 1.6.7 胶体金抗体检测技术(GICA) | 第22页 |
| 1.7 研究的目的和意义 | 第22-24页 |
| 2 PEDV S 基因的亚克隆及原核表达 | 第24-40页 |
| 2.1 材料 | 第24-28页 |
| 2.1.1 细胞、抗体和毒株 | 第24页 |
| 2.1.2 菌株与载体 | 第24页 |
| 2.1.3 实验动物及阳性血清 | 第24页 |
| 2.1.4 主要试剂及其具体配制方法 | 第24-28页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第28页 |
| 2.2 方法 | 第28-35页 |
| 2.2.1 病毒的培养 | 第28页 |
| 2.2.2 PCR 引物设计与合成 | 第28-29页 |
| 2.2.3 S 基因的克隆与鉴定 | 第29-31页 |
| 2.2.4 S 基因优势抗原表位的选取和重组表达载体的构建与鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.5 目的基因表达载体的构建与鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2.6 S 基因重组表达载体的鉴定 | 第33页 |
| 2.2.7 重组表达菌的诱导表达 | 第33-34页 |
| 2.2.8 纯化蛋白的 SDS-PAGE 鉴定及其蛋白浓度的测定 | 第34页 |
| 2.2.9 重组蛋白的 Western-blotting 分析 | 第34-35页 |
| 2.3 结果 | 第35-40页 |
| 2.3.1 PEDV S 基因的扩增 | 第35页 |
| 2.3.2 重组质粒 pMD19-T-S 的酶切鉴定结果 | 第35-36页 |
| 2.3.3 序列测定及分析 | 第36-37页 |
| 2.3.4 S 基因优势抗原表位基因克隆载体的建立与鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.5 原核表达质粒 pET-28a（+）- SFN 的构建与鉴定 | 第38页 |
| 2.3.6 表达产物的 SDS-PAGE 分析 | 第38页 |
| 2.3.7 重组蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| 2.3.8 纯化蛋白的浓度测定 | 第39页 |
| 2.3.9 Western-blotting 鉴定 | 第39-40页 |
| 3 重组 S 蛋白间接 ELISA 方法的建立 | 第40-48页 |
| 3.1 材料 | 第40页 |
| 3.1.1 抗原和血清 | 第40页 |
| 3.1.2 抗体及其他实验材料 | 第40页 |
| 3.1.3 ELISA 主要试剂的配制 | 第40页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第40页 |
| 3.2 方法 | 第40-42页 |
| 3.2.1 间接 ELISA 试验条件的优化 | 第40-42页 |
| 3.2.2 特异性试验 | 第42页 |
| 3.2.3 试剂盒比较试验 | 第42页 |
| 3.3 结果 | 第42-48页 |
| 3.3.1 最佳抗原包被浓度和阴阳性血清稀释浓度的确定 | 第42-43页 |
| 3.3.2 酶标抗体最佳稀释倍数的确定 | 第43页 |
| 3.3.3 封闭液的确定 | 第43-44页 |
| 3.3.4 封闭时间的确定 | 第44页 |
| 3.3.5 待检血清反应时间的确定 | 第44-45页 |
| 3.3.6 酶标抗体作用时间确定 | 第45页 |
| 3.3.7 底物作用时间的确定 | 第45-46页 |
| 3.3.8 阴阳性临界值确定 | 第46页 |
| 3.3.9 交叉试验 | 第46-47页 |
| 3.3.10 试剂盒比较试验 | 第47-48页 |
| 4 单克隆抗体的制备 | 第48-54页 |
| 4.1 材料 | 第48-49页 |
| 4.1.1 细胞 | 第48页 |
| 4.1.2 实验动物 | 第48页 |
| 4.1.3 阳性血清 | 第48页 |
| 4.1.4 主要试剂和溶液 | 第48-49页 |
| 4.1.5 主要仪器设备 | 第49页 |
| 4.2 方法 | 第49-51页 |
| 4.2.1 小鼠免疫 | 第49页 |
| 4.2.2 间接 ELISA 反应条件的确定 | 第49页 |
| 4.2.3 细胞融合 | 第49-50页 |
| 4.2.4 阳性杂交瘤细胞株筛选及克隆 | 第50页 |
| 4.2.5 单克隆抗体细胞株的冻存、复苏及稳定性试验 | 第50-51页 |
| 4.2.6 单克隆抗体腹水的生产及预处理 | 第51页 |
| 4.2.7 单克隆抗体的 Western-blot 分析 | 第51页 |
| 4.3 结果 | 第51-54页 |
| 4.3.1 间接 ELISA 反应条件的确定 | 第51页 |
| 4.3.2 饲养细胞的制备 | 第51页 |
| 4.3.3 骨髓瘤细胞的制备 | 第51-52页 |
| 4.3.4 细胞融合与筛选 | 第52页 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性试验 | 第52页 |
| 4.3.6 单克隆抗体的特异性分析 | 第52-54页 |
| 5 讨论 | 第54-57页 |
| 5.1 PEDV S 蛋白的优势 | 第54页 |
| 5.2 PEDV 重组 S 蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 5.3 间接 ELISA 方法的建立 | 第55页 |
| 5.4 单克隆抗体的制备 | 第55-57页 |
| 6 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 附录 | 第63-65页 |
| 附录 A PEDV S 基因 HB/FN（JQ862712；China,2012）测序结果 | 第63-64页 |
| 附录 B 同源性分析 | 第64-65页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第65-66页 |
| 作者简历 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
