| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第11-21页 |
| 1.1 选题背景和研究意义 | 第11-13页 |
| 1.2 帕金森氏病的介绍 | 第13-14页 |
| 1.2.1 帕金森氏病的发病机制及病理特征 | 第13-14页 |
| 1.3 多巴胺及多巴胺能神经元 | 第14-15页 |
| 1.4 NR4A2/NURR1与多巴胺能神经元 | 第15-16页 |
| 1.5 MICRORNA简介及作用机制 | 第16-17页 |
| 1.6 MIRNA在多巴胺能神经元的生物学作用 | 第17-18页 |
| 1.7 MIRNA对帕金森氏病的影响 | 第18-19页 |
| 1.8 多巴胺能神经元的分化研究进展 | 第19-21页 |
| 第2章 材料与方法 | 第21-27页 |
| 2.1 仪器和设备 | 第21-27页 |
| 2.1.1 仪器和设备 | 第21-22页 |
| 2.1.2 试剂和耗材 | 第22-24页 |
| 2.1.3 引物序列 | 第24-25页 |
| 2.1.4 质粒构建 | 第25-26页 |
| 2.1.5 动物、细胞和质粒 | 第26-27页 |
| 第3章 实验方法 | 第27-63页 |
| 3.1 实验总思路 | 第27页 |
| 3.2 293T细胞培养 | 第27-29页 |
| 3.2.1 293T细胞复苏 | 第27-28页 |
| 3.2.2 293T细胞的传代 | 第28-29页 |
| 3.3 小鼠神经干细胞(NPC)培养 | 第29-32页 |
| 3.3.1 小鼠神经干细胞(NPC)原代培养 | 第29-30页 |
| 3.3.2 小鼠神经干细胞(NPC)传代培养 | 第30-31页 |
| 3.3.3 神经干细胞克隆球染色(干性鉴定) | 第31-32页 |
| 3.4 MEF饲养层的制作 | 第32-34页 |
| 3.4.1 MEF细胞的获得 | 第32-33页 |
| 3.4.2 MEF细胞传代培养 | 第33-34页 |
| 3.4.3 MEF细胞γ射线处理 | 第34页 |
| 3.5 ES细胞培养 | 第34-36页 |
| 3.5.1 ES细胞复苏 | 第34-35页 |
| 3.5.2 ES细胞传代培养 | 第35-36页 |
| 3.6 LUCIFERASE检测 | 第36-38页 |
| 3.6.1 293T细胞的传代培养 | 第36页 |
| 3.6.2 miRNA与靶基因NR4A2共转染 | 第36-37页 |
| 3.6.3 Luciferlase检测 | 第37-38页 |
| 3.7 LENTI-MIRNA分子克隆构建 | 第38-43页 |
| 3.7.1 质粒提取 | 第38-39页 |
| 3.7.2 Top质粒、lenti载体酶切和酶连 | 第39-41页 |
| 3.7.3 转化和挑克隆摇菌 | 第41-42页 |
| 3.7.4 测序和比对 | 第42页 |
| 3.7.5 保种 | 第42页 |
| 3.7.6 中提质粒 | 第42-43页 |
| 3.8 慢病毒转染与感染 | 第43-45页 |
| 3.8.1 病毒转染 | 第43-44页 |
| 3.8.2 病毒感染 | 第44-45页 |
| 3.9 WESTERN BLOTTING检测靶基因NR4A2表达 | 第45-53页 |
| 3.9.1 细胞收集、蛋白提取及测定 | 第45-47页 |
| 3.9.2 Western Blotting蛋白检测NR4A2蛋白表达 | 第47-53页 |
| 3.10 Q-PCR检测目的基因的NR4A2表达 | 第53-56页 |
| 3.10.1 RNA提取 | 第53-54页 |
| 3.10.2 RT-PCR(逆转录PCR) | 第54-56页 |
| 3.11 小鼠ES向多巴胺能神经元的自发分化 | 第56-58页 |
| 3.12 ES向多巴胺能神经元的诱导分化 | 第58-61页 |
| 3.13 QPCR检测ES向多巴胺能神经元分化结束后基因的表达 | 第61页 |
| 3.14 胚胎中脑干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化 | 第61-63页 |
| 第4章 结果与分析 | 第63-84页 |
| 4.1 LUCIFERASE检测 | 第63-64页 |
| 4.1.1 293T细胞的贴壁培养 | 第63页 |
| 4.1.2 Luciferase检测 | 第63-64页 |
| 4.2 LENTI-MIRNA克隆构建 | 第64-65页 |
| 4.3 慢病毒包装转染293T细胞 | 第65-67页 |
| 4.4 NPC克隆球染色鉴定 | 第67-68页 |
| 4.4.1 NPC细胞悬浮培养 | 第67页 |
| 4.4.2 NPC克隆球干性鉴定 | 第67-68页 |
| 4.5 病毒感染NPC | 第68-71页 |
| 4.5.1 NPC贴壁培养 | 第68-69页 |
| 4.5.2 病毒感染 | 第69-71页 |
| 4.6 NR4A2的WESTERN BLOTTING检测 | 第71页 |
| 4.7 NR4A2的REAL-TIME-PCR检测 | 第71-72页 |
| 4.8 ES分化 | 第72-80页 |
| 4.8.1 ES培养 | 第72-73页 |
| 4.8.2 悬EB球(拟胚体) | 第73页 |
| 4.8.3 ES自发分化 | 第73-74页 |
| 4.8.4 多巴胺能神经元的诱导分化 | 第74-80页 |
| 4.9 ES细胞向多巴胺能神经元分化的REAL-TIME-PCR检测 | 第80-81页 |
| 4.10 中脑干细胞诱导分化多巴胺能神经元 | 第81-84页 |
| 第5章 讨论 | 第84-88页 |
| 5.1 EB球贴壁感染病毒后出现的问题 | 第84页 |
| 5.2 分化效率不稳定的原因 | 第84页 |
| 5.3 纯化多巴胺能神经元 | 第84-85页 |
| 5.4 MIRNAs对多巴胺能神经元分化影响的结果分析 | 第85-86页 |
| 5.5 MIRNAs作为新兴生物药物治疗帕金森疾病的展望 | 第86-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-94页 |
