| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 一 文献综述 | 第16-38页 |
| (一) 植物小分子化合物的糖基化与糖基转移酶 | 第16-22页 |
| 1 植物的糖基转移酶多基因家族 | 第16-19页 |
| 1.1 植物的糖基转移酶多基因家族 | 第16-17页 |
| 1.2 植物小分子糖基转移酶的结构 | 第17-19页 |
| 2 糖基转移酶基因鉴定 | 第19-20页 |
| 2.1 生物信息学和生物化学结合的方法 | 第19页 |
| 2.2 生物化学方法 | 第19页 |
| 2.3 分子生物学方法 | 第19-20页 |
| 2.4 遗传学方法 | 第20页 |
| 3 糖基转移酶的生物学功能 | 第20-22页 |
| 3.1 参与植物激素平衡 | 第20-21页 |
| 3.2 参与植物次生代谢 | 第21页 |
| 3.3 参与植物防御反应 | 第21页 |
| 3.4 参与植物脱毒反应 | 第21-22页 |
| 3.5 参与植物信号转导 | 第22页 |
| (二) 生长素的生物合成 | 第22-27页 |
| 1 植物生长素的色氨酸合成途径 | 第22-23页 |
| 2 ANA与色氨酸合成 | 第23-24页 |
| 3 YUCCA途径 | 第24-25页 |
| 4 IPA途径 | 第25页 |
| 5 非色氨酸依赖的生长素合成 | 第25-26页 |
| 6 生长素的共价结合修饰 | 第26-27页 |
| 6.1 低分子化合物的缀合态生长素 | 第27页 |
| 6.2 高分子化合物的缀合态生长素 | 第27页 |
| (三) 苯丙烷代谢途径 | 第27-36页 |
| 1 苯丙烷代谢 | 第27-29页 |
| 2 简单酚类化合物 | 第29-31页 |
| 2.1 简单酚类化合物的分类 | 第29-30页 |
| 2.2 简单酚类化合物的作用 | 第30-31页 |
| 3 木质素的合成途径及作用 | 第31-32页 |
| 3.1 木质素单体以及合成途径 | 第31页 |
| 3.2 木质素的作用 | 第31-32页 |
| 4 黄酮类化合物合成及其生物合成途径 | 第32-33页 |
| 4.1 黄酮类的代谢途径 | 第32-33页 |
| 5 芥子酸的性质 | 第33-36页 |
| 5.1 芥子酸的代谢 | 第33-35页 |
| 5.2 芥子酸糖基转移酶 | 第35页 |
| 5.3 酰基转移酶 | 第35-36页 |
| 5.4 芥子酰胆碱酯酶 | 第36页 |
| (四) 本研究的目的意义 | 第36-38页 |
| 二 材料方法 | 第38-52页 |
| (一) 实验材料 | 第38-40页 |
| 1 菌株与载体 | 第38页 |
| 2 植物材料 | 第38页 |
| 3 主要试剂 | 第38-39页 |
| 4 主要溶液与培养 | 第39-40页 |
| 4.1 主要溶液配方 | 第39页 |
| 4.2 主要培养基 | 第39-40页 |
| (二) 实验方法 | 第40-52页 |
| 1 候选基因的预测 | 第40-41页 |
| 1.1 水稻生长素糖基转移酶基因的预测 | 第40页 |
| 1.2 水稻苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的预测 | 第40页 |
| 1.3 毛白杨苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的预测 | 第40-41页 |
| 2 候选基因的克隆 | 第41-45页 |
| 2.1 RNA提取 | 第41页 |
| 2.2 PCR法扩增候选基因 | 第41-43页 |
| 2.3 候选基因的平端克隆转化 | 第43页 |
| 2.4 大肠杆菌感受态制备及转化 | 第43-44页 |
| 2.5 阳性克隆的筛选 | 第44-45页 |
| 2.5.1 质粒的提取 | 第44-45页 |
| 2.5.2 质粒的酶切验证 | 第45页 |
| 3 原核表达载体的构 | 第45-46页 |
| 3.1 质粒和基因片段的酶切 | 第45-46页 |
| 3.2 XL1-Blue感受态的制备及转化(同2.4) | 第46页 |
| 3.3 阳性克隆的筛选(同2.5) | 第46页 |
| 4 GST融合蛋白的表达纯化 | 第46-47页 |
| 4.1 GST融合蛋白的表达及提取 | 第46页 |
| 4.2 GST融合蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 4.2.1 Glutathione Sepharose 4B的制备 | 第46-47页 |
| 5 蛋白纯度和浓度测定 | 第47-48页 |
| 5.1 SDS-PAGE胶测蛋白纯度 | 第47-48页 |
| 5.2 蛋白浓度测定 | 第48页 |
| 6 酶促反应条件 | 第48-49页 |
| 6.1 体外酶活鉴定(定性反应) | 第48-49页 |
| 6.2 原核表达蛋白对不同底物转化率的影响 | 第49页 |
| 7 影响酶活的因素分析 | 第49-50页 |
| 7.1 温度对酶活性影响 | 第49页 |
| 7.2 pH对酶活性影响 | 第49-50页 |
| 8 动力学参数分析 | 第50页 |
| 8.1 重组蛋白与底物的时间线性关系 | 第50页 |
| 8.2 重组蛋白与底物反应的动力学常数测定 | 第50页 |
| 9 HPLC分析条件 | 第50页 |
| 10 标准曲线的制作 | 第50-52页 |
| 10.1 IAA标准曲线制作 | 第50-51页 |
| 10.2 IBA标准曲线制作 | 第51-52页 |
| 三 实验结果 | 第52-94页 |
| (一) 水稻生长素糖基转移酶基因克隆与酶活性鉴定 | 第52-66页 |
| 1 水稻生长素糖基转移酶基因的预测及进化树分析 | 第52-54页 |
| 1.1 水稻生长素糖基转移酶基因预测 | 第52页 |
| 1.2 候选基因的进化树分析 | 第52-54页 |
| 2 水稻生长素糖基转移酶基因的克隆与原核表达载体的构建 | 第54-56页 |
| 2.1 水稻生长素糖基转移酶基因的克隆 | 第54页 |
| 2.2 OsIAGT1基因阳性克隆载体鉴定 | 第54-55页 |
| 2.3 OsIAGT1基因原核表达载体的构建 | 第55-56页 |
| 3 纯化的原核表达蛋白与生长素的反应 | 第56-61页 |
| 3.1 生长素糖基转移酶活性基因的筛选 | 第56页 |
| 3.2 OsIAGT1对生长素IAA的反应 | 第56-58页 |
| 3.3 OsIAGT1对生长素IBA的反应 | 第58-59页 |
| 3.4 OsIAGT1对生长素类似物NAA的反应 | 第59页 |
| 3.5 OsIAGT1对生长素类似物2,4-D的反应 | 第59-60页 |
| 3.6 OsIAGT1对生长素前体物IPA的反应 | 第60-61页 |
| 3.7 OsIAGT1对生长素ICA的反应 | 第61页 |
| 4 OsIAGTl对不同底物转化率的比较 | 第61-62页 |
| 5 影响酶活性因素分析 | 第62-64页 |
| 5.1 温度对OsIAGT1活性的影响 | 第62-63页 |
| 5.2 Buffer和pH对OsIAGT1活性的影响 | 第63-64页 |
| 6 动力学常数分析 | 第64-66页 |
| 6.1 OsIAGT1参与IAA催化反应的时间线性关系 | 第64页 |
| 6.2 OsIAGT1参与IAA催化反应的动力学常数计算 | 第64-65页 |
| 6.3 OsIAGT1对IAA、IBA的动力学常数 | 第65-66页 |
| (二) 水稻和杨树苯丙烷代谢糖基转移酶基因克隆与酶活性鉴定 | 第66-85页 |
| 1 水稻苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的预测及进化树分析 | 第66-67页 |
| 1.1 水稻苯丙烷代谢糖基转移酶基因预测 | 第66页 |
| 1.2 候选基因的进化树分析 | 第66-67页 |
| 2 水稻苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的克隆与原核表达载体的构建 | 第67-69页 |
| 2.1 水稻苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的克隆 | 第67页 |
| 2.2 OsSGT1基因阳性克隆载体鉴定 | 第67-68页 |
| 2.3 OsSGT1基因原核表达载体的构建 | 第68-69页 |
| 3 纯化的原核表达蛋白与苯丙烷代谢相关底物的反应 | 第69-73页 |
| 3.1 苯丙烷代谢相关底物糖基转移酶活性基因的筛选 | 第69页 |
| 3.2 OsSGT1对芥子酸的反应 | 第69-70页 |
| 3.3 OsSGT1对阿魏酸的反应 | 第70-71页 |
| 3.4 OsSGT1对咖啡酸的反应 | 第71页 |
| 3.5 OsSGT1对肉桂酸的反应 | 第71-72页 |
| 3.6 OsSGT1对对香豆酸的反应 | 第72-73页 |
| 4 毛白杨苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的预测及进化树分析 | 第73页 |
| 4.1 毛白杨苯丙烷代谢糖基转移酶基因预测 | 第73页 |
| 4.2 候选基因的进化树分析 | 第73页 |
| 5 毛白杨苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的克隆与原核表达载体的构建 | 第73-77页 |
| 5.1 杨树苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的克隆 | 第73-74页 |
| 5.2 杨树苯丙烷代谢相关基因阳性克隆载体鉴定 | 第74-76页 |
| 5.3 PtSGT1-3基因原核表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 6 纯化的原核表达蛋白与苯丙烷代谢相关底物的反应 | 第77-85页 |
| 6.1 苯丙烷代谢相关底物糖基转移酶活性基因的筛选 | 第77-78页 |
| 6.2 PtSGT1对芥子酸的催化活性 | 第78-79页 |
| 6.3 PtSGT1对阿魏酸的催化活性 | 第79页 |
| 6.4 PtSGT1对咖啡酸的催化活性 | 第79-80页 |
| 6.5 PtSGT1对肉桂酸的催化活性 | 第80-81页 |
| 6.6 PtSGT1对对香豆酸的催化活性 | 第81页 |
| 6.7 PtSGT3对芥子酸的反应 | 第81-82页 |
| 6.8 PtSGT3对阿魏酸的反应 | 第82-83页 |
| 6.9 PtSGT3对咖啡酸的反应 | 第83页 |
| 6.10 PtSGT3对肉桂酸的反应 | 第83-84页 |
| 6.11 PtSGT3对对香豆酸的反应 | 第84-85页 |
| (三) 基因突变对糖基转移酶UGT76C2酶活性的影响以及转基因植物的表型分析 | 第85-94页 |
| 1 突变位点以及蛋白保守性分析 | 第85-86页 |
| 1.1 氨基酸突变位点(L31H) | 第85-86页 |
| 1.2 突变位点保守性 | 第86页 |
| 2 原核表达载体构建与蛋白纯化 | 第86-87页 |
| 2.1 含UGT76C2,UGT76C2m的表达载体构建 | 第86页 |
| 2.2 表达载体的验证 | 第86-87页 |
| 3 纯化GST融合蛋白 | 第87-88页 |
| 4 体外融合蛋白对细胞分裂素的糖基转移酶活性验证 | 第88-90页 |
| 4.1 UGT76C2和UGT76C2m对6-BA的催化活性 | 第88-90页 |
| 4.2 UGT76C2和UGT76C2m对Trans-Zeatin的催化活性 | 第90页 |
| 5 拟南芥UGT76C2m过表达纯合体株系的表型及生理分析 | 第90-94页 |
| 5.1 根延伸抑制 | 第91-92页 |
| 5.2 细胞分裂素及其糖苷含量测定 | 第92-94页 |
| 四 讨论及创新点 | 第94-100页 |
| (一) 水稻生长素糖基转移酶活性及生化特性 | 第94-96页 |
| 1 水稻生长素糖基转移酶活性 | 第94-95页 |
| 2 水稻生长素糖基转移酶的酶学性质 | 第95-96页 |
| (二) 水稻和杨树中苯丙烷代谢相关糖基转移酶 | 第96-97页 |
| 1 水稻苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因克隆 | 第96-97页 |
| 2 杨树苯丙烷代谢相关糖基转移酶基因的克隆鉴定 | 第97页 |
| (三) 基因突变对糖基转移酶UGT76C2酶活性的影响以及转基因植物的表型分析 | 第97-99页 |
| (四) 本论文的创新点 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第106页 |
