| 中文摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 文献综述 | 第14-23页 |
| 1 植物病害生物防治概述 | 第14-15页 |
| 1.1 植物病害生物防治发展 | 第14页 |
| 1.2 植物病害生物防治的主要内容 | 第14-15页 |
| 2 极端嗜热微生物（Hyperthermophiles）概述 | 第15-17页 |
| 2.1 极端嗜热微生物的分布 | 第15页 |
| 2.2 极端嗜热微生物的分类 | 第15页 |
| 2.3 古菌Thermococcus kodakarensis KOD1 | 第15-17页 |
| 3 蛋白酶概述 | 第17-20页 |
| 3.1 蛋白酶 | 第17页 |
| 3.2 蛋白酶分类 | 第17-18页 |
| 3.3 TldD/Pmb A家族蛋白酶 | 第18-19页 |
| 3.4 蛋白酶在生物防治中的应用 | 第19页 |
| 3.5 蛋白酶酶活性的测定方法 | 第19-20页 |
| 4 大肠杆菌原核表达系统概述 | 第20-21页 |
| 4.1 大肠杆菌原核表达系统 | 第20页 |
| 4.2 载体的选择 | 第20-21页 |
| 4.3 载体的选择 | 第21页 |
| 4.4 pET表达系统 | 第21页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第21-23页 |
| 第一章 古菌蛋白酶TPP的克隆、原核表达和提纯 | 第23-41页 |
| 1 实验材料 | 第23-26页 |
| 1.1 实验所用菌株与载体 | 第23页 |
| 1.2 实验所用试剂 | 第23页 |
| 1.3 实验所用主要仪器 | 第23-24页 |
| 1.4 实验所用培养基与试剂配制 | 第24-26页 |
| 2. 实验方法 | 第26-33页 |
| 2.1 编码TPP的Tk0499基因的克隆 | 第26-30页 |
| 2.2 原核表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.3 重组蛋白酶TPP的原核表达 | 第31-32页 |
| 2.4 重组蛋白酶TPP的纯化 | 第32页 |
| 2.5 纯化后的重组蛋白酶TPP的透析与浓度测定 | 第32-33页 |
| 3. 结果与分析 | 第33-40页 |
| 3.1 序列分析 | 第33-35页 |
| 3.2 PCR扩增Tk0499基因结果 | 第35-36页 |
| 3.3 构建pMD18-T::TPP重组质粒验证结果 | 第36-37页 |
| 3.4 构建pET28a::TPP重组质粒验证结果 | 第37-38页 |
| 3.5 TPP原核表达与纯化 | 第38-39页 |
| 3.6 TPP的透析与浓度测定 | 第39-40页 |
| 4 小结与讨论 | 第40-41页 |
| 第二章 古菌蛋白酶TPP的酶学特性分析 | 第41-50页 |
| 1 实验材料 | 第41-42页 |
| 1.1 实验所用试剂 | 第41页 |
| 1.2 实验所用主要仪器 | 第41页 |
| 1.3 实验所用试剂配制 | 第41-42页 |
| 1.3.1 1M Tris-Hcl Buffer | 第41页 |
| 1.3.2 0.65%酪蛋白 | 第41页 |
| 1.3.3 2×Loading Buffer | 第41-42页 |
| 1.3.4 调节pH缓冲液 | 第42页 |
| 2 实验方法 | 第42-43页 |
| 2.1 TPP酶水解能力测定 | 第42页 |
| 2.2 TPP自我剪切检测 | 第42-43页 |
| 2.3 TPP自我剪切温度影响 | 第43页 |
| 2.4 质谱分析 | 第43页 |
| 2.5 S-TPP酶水解能力测定 | 第43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-48页 |
| 3.1 TPP酶水解能力 | 第43-44页 |
| 3.2 TPP自我剪切现象 | 第44-45页 |
| 3.3 质谱分析结果 | 第45-47页 |
| 3.4 S-TPP酶水解能力 | 第47-48页 |
| 4 小结与讨论 | 第48-50页 |
| 第三章 S-TPP的酶活特性鉴定 | 第50-60页 |
| 1 实验材料 | 第50-52页 |
| 1.1 实验所用菌株与载体 | 第50页 |
| 1.2 实验所用试剂 | 第50-51页 |
| 1.3 实验所用主要仪器 | 第51页 |
| 1.4 实验所用培养基与试剂配制 | 第51-52页 |
| 2 实验方法 | 第52-53页 |
| 2.1 S-TPP的克隆、原核表达与纯化 | 第52页 |
| 2.2 重组S-TPP的酶水解能力测定 | 第52页 |
| 2.3 Westen Bolt | 第52-53页 |
| 2.3.1 多克隆抗体制备 | 第52页 |
| 2.3.2 Westen Bolt步骤 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-59页 |
| 3.2 PCR扩增S-TPP编码基因结果 | 第53-54页 |
| 3.3 构建pMD18-T::TPP重组质粒验证结果 | 第54-55页 |
| 3.4 构建pET28a::S-TPP重组质粒验证结果 | 第55-56页 |
| 3.5 重组S-TPP原核表达与纯化 | 第56-57页 |
| 3.6 重组S-TPP酶水解能力 | 第57-58页 |
| 3.7 古菌T. kodakarensis KOD1体内TPP存在的形式 | 第58-59页 |
| 4 小结与讨论 | 第59-60页 |
| 第四章 S-TPP酶动力学研究 | 第60-67页 |
| 1 实验材料 | 第60-61页 |
| 1.1 实验所用菌株与载体 | 第60页 |
| 1.2 实验所用试剂 | 第60页 |
| 1.3 实验所用主要仪器 | 第60页 |
| 1.4 实验所用试剂配制 | 第60-61页 |
| 2 实验方法 | 第61-63页 |
| 2.1 S-TPP最适反应温度测定 | 第61页 |
| 2.2 S-TPP最适反应p H测定 | 第61-62页 |
| 2.3 S-TPP稳定性测定 | 第62页 |
| 2.4 EDTA和不同金属离子对S-TPP活性的影响 | 第62-63页 |
| 2.5 酪氨酸浓度标准曲线测定 | 第63页 |
| 3 结果与分析 | 第63-66页 |
| 3.1 酪氨酸浓度标准曲线 | 第63-64页 |
| 3.2 S-TPP最适反应温度和pH | 第64-65页 |
| 3.3 S-TPP热稳定性和pH稳定性 | 第65页 |
| 3.4 金属离子对S-TPP酶活力的影响 | 第65-66页 |
| 4 小结与讨论 | 第66-67页 |
| 结论与讨论 | 第67-69页 |
| 1 结论 | 第67页 |
| 2 讨论 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 附录 | 第76-77页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
