| 摘要 | 第7-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第11-22页 |
| 1.1 课题的提出 | 第11页 |
| 1.2 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.2.1 ARF基因家族蛋白的结构 | 第12-16页 |
| 1.2.2 在植物中ARF基因的激活、互作和调控机理 | 第16-19页 |
| 1.2.3 ARFs在植物生长发育过程中的作用 | 第19-20页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 | 第20-21页 |
| 1.3 本研究的目的和主要内容 | 第21-22页 |
| 2 材料和方法 | 第22-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第22-23页 |
| 2.1.2 菌株和载体质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.3 实验主要试剂和仪器 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-37页 |
| 2.2.1 生物信息分析方法 | 第25-26页 |
| 2.2.1.1 柑橘ARF基因的鉴定与分离 | 第25页 |
| 2.2.1.2 保守模体分析和亚细胞定位预测 | 第25页 |
| 2.2.1.3 Ci ARFs的基因结构和染色体定位 | 第25-26页 |
| 2.2.1.4 Ci ARFs的系统进化和启动子序列分析 | 第26页 |
| 2.2.2 Ci ARFs基因表达分析相关方法 | 第26-30页 |
| 2.2.2.1 总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.2.2 第一链c DNA合成 | 第27-28页 |
| 2.2.2.3 实时荧光定量PCR检测 | 第28页 |
| 2.2.2.4 定量引物设计 | 第28-30页 |
| 2.2.3 Ci ARF16超表达载体的构建 | 第30-33页 |
| 2.2.3.1 目的片段的扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.3.2 目的片段回收 | 第31页 |
| 2.2.3.3 AT克隆 | 第31页 |
| 2.2.3.4 目的片段重组引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2.3.5 线性化克隆载体制备 | 第32页 |
| 2.2.3.6 一步法重组反应 | 第32-33页 |
| 2.2.3.7 大肠杆菌转化 | 第33页 |
| 2.2.4 CRISPR载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.5 质粒转化农杆菌感受态 | 第34页 |
| 2.2.6 柑橘愈伤组织转化 | 第34-35页 |
| 2.2.7 拟南芥遗传转化 | 第35-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-63页 |
| 3.1 Ci ARFs基因的鉴定 | 第37-39页 |
| 3.2 Ci ARFs基因系统进化和基因结构分析及基因注释 | 第39-41页 |
| 3.3 Ci ARF蛋白的结构分析 | 第41-43页 |
| 3.4 Ci ARF基因在染色体上的分布 | 第43-44页 |
| 3.5 Ci ARF基因启动子区顺式模体预测 | 第44-46页 |
| 3.6 Ci ARF基因在甜橙不同器官中表达情况分析 | 第46-48页 |
| 3.7 甜橙果实成熟过程Ci ARF基因的表达情况分析 | 第48页 |
| 3.8 经外源植物激素处理后Ci ARF基因表达分析 | 第48-52页 |
| 3.9 Ci ARF8和Ci ARF16基因功能的验证 | 第52-63页 |
| 3.9.1 构建CRISPR-Cas9载体 | 第52-54页 |
| 3.9.1.1 目的片段与线性化载体重组连接 | 第52-54页 |
| 3.9.1.2 农杆菌目的基因的PCR阳性检测 | 第54页 |
| 3.9.2 柑橘愈伤组织的遗传转化 | 第54页 |
| 3.9.3 鉴定转基因的愈伤组织 | 第54-55页 |
| 3.9.4 Ci ARF16超表达载体的构建 | 第55-56页 |
| 3.9.4.1 目的基因和质粒载体的酶切 | 第55页 |
| 3.9.4.2 重组反应 | 第55-56页 |
| 3.9.4.3 农杆菌目的基因PCR检测 | 第56页 |
| 3.9.5 农杆菌介导的拟南芥转化 | 第56页 |
| 3.9.6 拟南芥筛选培养及其阳性鉴定 | 第56-57页 |
| 3.9.7 转基因拟南芥的表型统计分析 | 第57-63页 |
| 4 讨论 | 第63-68页 |
| 4.1 Ci ARF在系统进化上的保守性 | 第63-64页 |
| 4.2 Ci ARF表达模式的差异性 | 第64-65页 |
| 4.3 CIRISP-Cas9在柑橘转化中存在的问题 | 第65-66页 |
| 4.4 35S::Ci ARF16转基因拟南芥的表型变化及展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-76页 |
| 附录 | 第76-78页 |
| 1. 实验所需培养基配方 | 第76-77页 |
| 1.1 拟南芥转化培养基配方 | 第76页 |
| 1.2 拟南芥筛选培养基配方 | 第76页 |
| 1.3 伏令夏橙愈伤组织生长及转化培养基配方 | 第76-77页 |
| 2. 研究成果 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
