| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 本论文的缩写词表 | 第10-11页 |
| 第1章 绪论 | 第11-23页 |
| 1.1 Tn5转座方法 | 第11-13页 |
| 1.1.1 Tn5转座子的结构 | 第11页 |
| 1.1.2 Tn5转座反应的机制 | 第11-12页 |
| 1.1.3 Tn5转座的应用 | 第12-13页 |
| 1.2 伴侣蛋白简介 | 第13-16页 |
| 1.2.1 伴侣蛋白的功能 | 第13页 |
| 1.2.2 伴侣蛋白种类介绍 | 第13-15页 |
| 1.2.3 在E.coli中伴侣蛋白介导的蛋白质折叠 | 第15-16页 |
| 1.3 伴侣蛋白GroELS研究进展 | 第16-22页 |
| 1.3.1 伴侣蛋白GroEL的发现及其功能 | 第16-17页 |
| 1.3.2 伴侣蛋白GroELS的结构 | 第17-18页 |
| 1.3.3 伴侣蛋白GroEL的辅助伴侣蛋白GroES | 第18-19页 |
| 1.3.4 伴侣蛋白GroEL的配体 | 第19页 |
| 1.3.5 伴侣蛋白GroEL的底物 | 第19页 |
| 1.3.6 GroEL-GroES与底物的反应循环 | 第19-21页 |
| 1.3.7 过表达伴侣蛋白的副作用 | 第21-22页 |
| 1.4 本论文的研究内容及意义 | 第22-23页 |
| 第2章 Tn5转座酶介导的基因多次插入方法的建立 | 第23-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-29页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.2 本章中所用引物 | 第24-25页 |
| 2.1.3 分子生物学的相关酶 | 第25页 |
| 2.1.4 本论文所用试剂盒 | 第25-26页 |
| 2.1.5 本论文中所用主要生化试剂 | 第26页 |
| 2.1.6 试剂配制 | 第26-29页 |
| 2.1.7 本论文所用培养基的配制 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-36页 |
| 2.2.1 菌株保存 | 第29页 |
| 2.2.2 E.coli TSB法化学感受态制备 | 第29-30页 |
| 2.2.3 E.coli TSB法化学感受态的转化 | 第30页 |
| 2.2.4 E.coli电转感受态制备 | 第30页 |
| 2.2.5 SLIC组装方法 | 第30-31页 |
| 2.2.6 转座片段ME-T7-groELS-kan-ME的构建 | 第31-32页 |
| 2.2.7 Tn5转座酶的表达和纯化 | 第32页 |
| 2.2.8 BCA方法测定蛋白质浓度 | 第32-33页 |
| 2.2.9 PCR产物与pJET1.2/blunt载体连接 | 第33-34页 |
| 2.2.10 Tn5转座反应 | 第34页 |
| 2.2.11 PCR扩增 | 第34-35页 |
| 2.2.12 菌落PCR验证 | 第35页 |
| 2.2.13 Kan抗性的去除 | 第35页 |
| 2.2.14 质粒提取 | 第35-36页 |
| 2.2.15 琼脂糖凝胶产物的回收 | 第36页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第36-41页 |
| 2.3.1 构建表达载体pET28b::tnpA | 第36页 |
| 2.3.2 Tn5转座酶表达与纯化 | 第36-38页 |
| 2.3.3 转座片段ME-T7-groELS-kan-ME的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.4 Tn5转座反应优化 | 第39-40页 |
| 2.3.5 利用Tn5转座酶完成基因多次插入 | 第40-41页 |
| 2.4 本章小结 | 第41-42页 |
| 第3章 1-4个拷贝groELS工程菌构建 | 第42-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-43页 |
| 3.2.1 细菌基因组提取 | 第42页 |
| 3.2.2 细菌基因组重测序及生物信息学分析 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-45页 |
| 3.3.1 利用Tn5转座酶构建含有1-4个拷贝groELS的工程菌 | 第43-44页 |
| 3.3.2 1-4个拷贝groELS工程菌的生长情况 | 第44页 |
| 3.3.3 GroELS工程菌中整合位置的确定 | 第44-45页 |
| 3.4 本章小结 | 第45-47页 |
| 第4章 促进重组蛋白可溶性表达所需伴侣蛋白groELS的最佳拷贝数探索 | 第47-54页 |
| 4.1 实验材料 | 第47-48页 |
| 4.1.1 实验菌株和质粒 | 第47页 |
| 4.1.2 本章中所用引物 | 第47-48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 菌体处理、分析方法 | 第48页 |
| 4.2.2 来自P.aerμginosa的膜蛋白Sqr活性分析 | 第48-49页 |
| 4.2.3 来自人的ETHE1活性分析 | 第49页 |
| 4.3 实验结果 | 第49-52页 |
| 4.3.1 检测蛋白的选择 | 第49页 |
| 4.3.2 EmoA可溶性表达所需groELS最佳拷贝数探索 | 第49-50页 |
| 4.3.3 膜蛋白Sqr可溶性表达所需groELS最佳拷贝数探索 | 第50-51页 |
| 4.3.4 来自人的ETHE1可溶性表达所需groELS最佳拷贝数探索 | 第51-52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-53页 |
| 4.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 全文总结与展望 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第64页 |
