| 摘要 | 第9-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩略词(Abbreviation) | 第18-20页 |
| 第一章：绪论 | 第20-59页 |
| 1.1 纤维素的微生物降解 | 第20-22页 |
| 1.2 纤维素酶 | 第22-26页 |
| 1.2.1 纤维素酶的命名方式 | 第22-23页 |
| 1.2.2 瑞氏木霉的纤维素酶系统 | 第23-26页 |
| 1.3 糖蛋白的糖基化 | 第26-34页 |
| 1.3.1 糖蛋白糖基化修饰的种类 | 第26-28页 |
| 1.3.2 N-糖基化修饰产生及修饰过程 | 第28-30页 |
| 1.3.3 N-糖基化修饰与糖蛋白折叠 | 第30-32页 |
| 1.3.4 糖蛋白糖基化修饰的重要性 | 第32-34页 |
| 1.4 内质网中的质量控制系统 | 第34-41页 |
| 1.4.1 蛋白折叠与ER中的QC系统 | 第34-35页 |
| 1.4.2 主要的QC系统 | 第35-37页 |
| 1.4.3 Calnexin/calreticulin循环 | 第37-41页 |
| 1.5 折叠缺陷蛋白的ERAD途径 | 第41-45页 |
| 1.5.1 ERAD的降解信号 | 第41-43页 |
| 1.5.2 EDEM | 第43-44页 |
| 1.5.3 错误折叠蛋白的降解 | 第44-45页 |
| 1.6 真菌的糖基修饰酶类 | 第45-48页 |
| 1.6.1 真菌糖基修饰酶的种类 | 第45-47页 |
| 1.6.2 糖基修饰酶对N-糖基的修饰与蛋白折叠降解 | 第47-48页 |
| 1.6.3 糖基修饰酶的研究与纤维素酶的研究 | 第48页 |
| 1.7 纤维素酶的糖基化修饰 | 第48-57页 |
| 1.7.1 纤维素酶糖基化修饰的特点 | 第48-49页 |
| 1.7.2 瑞氏木霉纤维二糖水解酶CBH1的N-糖基化修饰 | 第49-51页 |
| 1.7.3 其他主要纤维素酶的N-糖基化位点及其糖基化修饰形式 | 第51-52页 |
| 1.7.4 糖基化修饰对纤维素酶的重要性 | 第52-57页 |
| 1.8 论文的立题依据及主要内容 | 第57-59页 |
| 第二章 △cbh1敲除菌株、CBH1原位回补及N-糖基化位点突变菌株的构建 | 第59-91页 |
| 2.1 材料与方法 | 第60-79页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第60页 |
| 2.1.2 试剂和仪器 | 第60-61页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第61-64页 |
| 2.1.4 培养基 | 第64-65页 |
| 2.1.5 常用缓冲液的配制 | 第65-66页 |
| 2.1.6 培养条件 | 第66-67页 |
| 2.1.7 原生质体转化与菌种筛选 | 第67页 |
| 2.1.8 Bp克隆(Dels gateway系统)构建载体的原理及其实验方法 | 第67-70页 |
| 2.1.9 敲除载体的构建 | 第70-73页 |
| 2.1.10 Southren blot | 第73-77页 |
| 2.1.11 pNPC酶活的测定方法 | 第77页 |
| 2.1.12 pNP标准曲线的制作 | 第77页 |
| 2.1.13 蛋白质含量测定 | 第77-78页 |
| 2.1.14 SDS-PAGE | 第78-79页 |
| 2.2 结果与讨论 | 第79-90页 |
| 2.2.1 纤维二糖水解酶I(CBH1)敲除菌株(△cbh1)的构建 | 第79-82页 |
| 2.2.2 △cbh1-FS菌株的构建 | 第82-83页 |
| 2.2.3 △cbh1△eg1敲除菌株的构建及反筛 | 第83-84页 |
| 2.2.4 野生回补菌株WT的构建 | 第84-86页 |
| 2.2.5 CBH1N-糖基化位点突变的瑞氏木霉菌株(M45 M270 M384 MD1 MD2MT)的构建 | 第86-88页 |
| 2.2.6 WT△cne1和MT△cne1敲除菌株的构建 | 第88-90页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第90-91页 |
| 第三章 N-糖基化修饰缺失对CBH1分泌和胞内分子伴侣转录量的影响 | 第91-107页 |
| 3.1 材料与方法 | 第91-96页 |
| 3.1.1 主要仪器及试剂 | 第91-92页 |
| 3.1.2 常用缓冲液的配制 | 第92页 |
| 3.1.3 蛋白质含量测定 | 第92页 |
| 3.1.4 SDS-PAGE | 第92页 |
| 3.1.5 western Blot检测 | 第92-93页 |
| 3.1.6 CBH1胞外分泌情况的研究 | 第93页 |
| 3.1.7 CBH1胞内滞留情况的研究 | 第93-94页 |
| 3.1.8 与折叠相关的转录因子转录量的研究 | 第94-96页 |
| 3.1.9 pNPC酶活的测定方法 | 第96页 |
| 3.1.10 WT△cne1和MT△cne1胞外分泌情况的研究 | 第96页 |
| 3.1.11 瑞氏木霉CBH1催化结构域的三维结构分析 | 第96页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第96-105页 |
| 3.2.1 瑞氏木霉CBH1催化结构域上N-糖基化位点的分析 | 第96-97页 |
| 3.2.2 N-糖基化的缺失对突变菌株粗酶液水解活性的影响 | 第97-98页 |
| 3.2.3 N-糖基化的缺失对CBH1分泌的影响 | 第98-101页 |
| 3.2.4 CBH1N-糖基缺失的突变菌株体内CBH1的滞留量研究 | 第101页 |
| 3.2.5 N-糖基化修饰的缺失对CBH1电泳速率的影响 | 第101-102页 |
| 3.2.6 MT中与折叠相关的分子伴侣的转录量的研究 | 第102-104页 |
| 3.2.7 WT△cne1和MT△cne1菌株中CBH1分泌量的研究 | 第104-105页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第105-107页 |
| 第四章 N-糖基化缺失的CBH1蛋白的纯化、酶活及蛋白稳定性的研究 | 第107-134页 |
| 4.1 材料与方法 | 第107-112页 |
| 4.1.1 主要试剂及仪器 | 第107-108页 |
| 4.1.2 CBH1的诱导发酵 | 第108-109页 |
| 4.1.3 发酵液的浓缩 | 第109页 |
| 4.1.4 浓缩样品的除盐 | 第109页 |
| 4.1.5 阴离子交换层析DEAE Sepharose Fast Flow | 第109-110页 |
| 4.1.6 阴离子交换柱层析Mono Q~(TM)5/50 GL | 第110页 |
| 4.1.7 目的蛋白的鉴定和性质分析 | 第110-112页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第112-132页 |
| 4.2.1 重组表达的CBH1的分离纯化条件的摸索 | 第112-118页 |
| 4.2.2 N-糖基化的缺失蛋白的质谱鉴定 | 第118-119页 |
| 4.2.3 SDS-PAGE检测重组CBH1的纯化 | 第119-120页 |
| 4.2.4 不同N-糖基缺失的CBH1水解活性的变化 | 第120-123页 |
| 4.2.5 N-糖基缺失CBH1蛋白的热稳定性检测 | 第123-129页 |
| 4.2.6 pH对N-糖基缺失CBH1的结构影响 | 第129-130页 |
| 4.2.7 C-末端融合的HA免疫标记并未改变重组CBH1的性质 | 第130-132页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第132-134页 |
| 第五章 瑞氏木霉α-1,2甘露糖苷酶(mns1p)和内质网降解增强α-甘露糖苷酶类似蛋白1(mnl1p)的体内功能研究 | 第134-157页 |
| 5.1 材料与方法 | 第135-139页 |
| 5.1.1 仪器和试剂 | 第135页 |
| 5.1.2 菌株、质粒 | 第135页 |
| 5.1.3 PCR引物 | 第135-137页 |
| 5.1.4 PNGase F处理糖蛋白 | 第137页 |
| 5.1.5 其他实验方法 | 第137页 |
| 5.1.6 敲除载体的构建策略 | 第137-139页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第139-155页 |
| 5.2.1 △mns1p菌株的构建 | 第139-141页 |
| 5.2.2 △mnl1p菌株的构建 | 第141-142页 |
| 5.2.3 △UGT菌株的构建 | 第142-143页 |
| 5.2.4 △mns1p和△mnl1p菌株在不同碳源上的生长实验 | 第143-144页 |
| 5.2.5 △mns1p和△mnl1p菌株菌丝形态的变化 | 第144页 |
| 5.2.6 mns1p和mnl1p基因的敲除对CBH1分泌的影响 | 第144-146页 |
| 5.2.7 △mns1p和Amnl1p敲除菌株诱导上清的Avicel酶活 | 第146-147页 |
| 5.2.8 △mns1p和△mnl1p敲除菌株诱导上清的pNPC酶活和CMC酶活 | 第147-148页 |
| 5.2.9 △mns1p和△mnl1p菌株分泌的CBH1的纯化 | 第148-152页 |
| 5.2.10 △mns1p和△mnl1p菌株来源的CBH1纯化蛋白的酶活检测 | 第152-153页 |
| 5.2.11 mns1p和mnl1p基因的敲除对CBH1热稳定性的影响 | 第153-155页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第155-157页 |
| 全文总结与展望 | 第157-160页 |
| 参考文献 | 第160-177页 |
| 致谢 | 第177-178页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第178-179页 |
| 附件 | 第179-189页 |
