| 摘要 | 第12-16页 |
| Abstract | 第16-20页 |
| 缩略词表(ABBREVIATION) | 第21-23页 |
| 第一章 绪论 | 第23-61页 |
| 1.1 L-赖氨酸概述 | 第23页 |
| 1.2 L-赖氨酸的应用 | 第23-25页 |
| 1.2.1 医学应用 | 第23-25页 |
| 1.2.1.1 促进人体正常生长发育 | 第24页 |
| 1.2.1.2 增强人体免疫力 | 第24页 |
| 1.2.1.3 预防心脑血管疾病 | 第24-25页 |
| 1.2.2 食品应用 | 第25页 |
| 1.2.3 饲料添加剂 | 第25页 |
| 1.3 L-赖氨酸的生产 | 第25-27页 |
| 1.3.1 二步发酵法 | 第26页 |
| 1.3.2 酶法 | 第26页 |
| 1.3.3 直接发酵法 | 第26-27页 |
| 1.4 L-赖氨酸的生物合成途径 | 第27-32页 |
| 1.4.1 天冬氨酸激酶 | 第28-29页 |
| 1.4.2 天冬氨酸半醛脱氢酶 | 第29页 |
| 1.4.3 二氢吡啶甲酸合酶 | 第29-31页 |
| 1.4.4 DAP操纵子 | 第31-32页 |
| 1.5 大肠杆菌中L-赖氨酸生物合成的主要影响因素 | 第32-38页 |
| 1.5.1 L-赖氨酸合成途径中关键酶的调控 | 第32-35页 |
| 1.5.1.1 L-赖氨酸合成途径中关键酶的基因表达调控 | 第32-33页 |
| 1.5.1.2 L-赖氨酸合成途径中关键酶的反馈抑制调控 | 第33-35页 |
| 1.5.2 L-赖氨酸合成途径中前体物水平带来的影响 | 第35-36页 |
| 1.5.3 L-赖氨酸在细胞内的分解代谢 | 第36-37页 |
| 1.5.4 L-赖氨酸的转运系统 | 第37-38页 |
| 1.6 在重组大肠杆菌中提高L-赖氨酸产量的策略 | 第38-41页 |
| 1.6.1 解除L-赖氨酸合成途径中的关键酶所受到的反馈抑制作用 | 第38-39页 |
| 1.6.2 提高L-赖氨酸生物合成途径中的前体物水平 | 第39-41页 |
| 1.6.3 细胞内L-赖氨酸的积累与转运限制等方面的解除 | 第41页 |
| 1.7 核糖开关的基本概念 | 第41-58页 |
| 1.7.1 核糖开关的发现历史 | 第42页 |
| 1.7.2 核糖开关的结构 | 第42-44页 |
| 1.7.3 核糖开关的底物特异性研究 | 第44-48页 |
| 1.7.4 核糖开关与底物结合的化学动力学特性 | 第48-50页 |
| 1.7.5 核糖开关调控基因表达的原理 | 第50-52页 |
| 1.7.6 核糖开关可以作为新的药物作用靶点 | 第52-53页 |
| 1.7.7 核糖开关在代谢工程改造微生物方面的应用 | 第53-55页 |
| 1.7.8 构建并筛选所需的核糖开关 | 第55-58页 |
| 1.8 本论文的研究工作和意义 | 第58-61页 |
| 第二章 L-赖氨酸基本生产菌株的构建 | 第61-103页 |
| 2.1 实验材料 | 第63-72页 |
| 2.1.1 实验所用菌株和质粒 | 第63-64页 |
| 2.1.2 本章用于遗传操作的引物序列 | 第64-66页 |
| 2.1.3 分子生物学常用酶 | 第66页 |
| 2.1.4 常用试剂盒 | 第66页 |
| 2.1.5 常用生化试剂与药品 | 第66页 |
| 2.1.6 分子量标准物 | 第66-67页 |
| 2.1.7 仪器和设备 | 第67-68页 |
| 2.1.8 实验室常用试剂配方 | 第68-72页 |
| 2.1.8.1 分子生物学常用溶液以及Buffer缓冲液的配制 | 第68-70页 |
| 2.1.8.2 实验室常用培养基的配制 | 第70-72页 |
| 2.1.8.3 实验室常用抗生素以及其他试剂药品的配制 | 第72页 |
| 2.2 试验方法 | 第72-88页 |
| 2.2.1 菌种的保藏方法 | 第72页 |
| 2.2.2 实验室常用的分子生物学操作技术 | 第72-77页 |
| 2.2.2.1 DNA序列的PCR产物的纯化与回收 | 第73页 |
| 2.2.2.2 实验室常用的质粒DNA提取方法 | 第73-74页 |
| 2.2.2.3 凝胶电泳产物的胶回收 | 第74-76页 |
| 2.2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第76页 |
| 2.2.2.5 大肠杆菌的普通转化 | 第76-77页 |
| 2.2.2.6 一步法快速提取质粒 | 第77页 |
| 2.2.3 大肠杆菌MG1655中cadA、ldcC以及ptsG基因的敲除 | 第77-81页 |
| 2.2.3.1 cadA以及ldcC基因同源重组敲除片段的PCR克隆 | 第77-78页 |
| 2.2.3.2 电转化大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第78-79页 |
| 2.2.3.3 将外源的DNA片段电转入大肠杆菌 | 第79页 |
| 2.2.3.4 电转重组子的筛选与验证 | 第79-80页 |
| 2.2.3.5 重组酶质粒pTKRed的去除 | 第80-81页 |
| 2.2.3.6 去除MG1655/△cadA的卡那霉素抗性片段 | 第81页 |
| 2.2.4 大肠杆菌MG1655中sucC/D和pgi基因的敲除 | 第81-84页 |
| 2.2.4.1 sucC/D和pgi基因的同源重组敲除片段的构建与PCR克隆 | 第81-83页 |
| 2.2.4.2 电转化大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第83页 |
| 2.2.4.3 将外源的DNA片段电转入大肠杆菌 | 第83页 |
| 2.2.4.4 电转重组子的筛选与验证 | 第83页 |
| 2.2.4.5 重组酶质粒pTKRed的去除 | 第83页 |
| 2.2.4.6 去除MG1655/△sucC/D上的卡那霉素抗性片段 | 第83-84页 |
| 2.2.5 重组质粒pCLIV的构建 | 第84-87页 |
| 2.2.5.1 编码天冬氨酸激酶的Ⅲ lysC基因的PCR扩增及定点突变 | 第84-85页 |
| 2.2.5.2 编码二氢吡啶甲酸合酶的dapA基因的PCR扩增及定点突变 | 第85页 |
| 2.2.5.3 重组质粒pCL1920-ddh-lysA的构建 | 第85-86页 |
| 2.2.5.4 重组质粒pCL1920-lysC~(fbr)-dapA~(fbr)-ddh-lysA的构建 | 第86-87页 |
| 2.2.6 L-赖氨酸基本发酵菌株的构建 | 第87页 |
| 2.2.7 L-赖氨酸的发酵方法 | 第87-88页 |
| 2.2.7.1 发酵种子的培养 | 第87-88页 |
| 2.2.7.2 摇瓶发酵培养 | 第88页 |
| 2.2.8 测定葡萄糖浓度 | 第88页 |
| 2.2.9 发酵液中细菌生长情况的检测 | 第88页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第88-101页 |
| 2.3.1 L-赖氨酸检测方法的确立 | 第88-93页 |
| 2.3.1.1 酸性茚三酮法 | 第88-89页 |
| 2.3.1.2 柱前衍生法 | 第89-92页 |
| 2.3.1.3 非柱前衍生法 | 第92-93页 |
| 2.3.2 L-赖氨酸基本发酵菌株的构建 | 第93-101页 |
| 2.3.2.1 野生型大肠杆菌MG1655 cadA、ldcC、sucC/D、pgi、ptsG基因的敲除 | 第93-94页 |
| 2.3.2.2 lysC与dapA基因的定点突变 | 第94-95页 |
| 2.3.2.3 重组质粒pCLIV的构建 | 第95-96页 |
| 2.3.2.4 L-赖氨酸基本菌株的构建以及摇瓶发酵检测 | 第96-98页 |
| 2.3.2.5 L-赖氨酸摇瓶发酵培养基的优化 | 第98-101页 |
| 2.3.2.6 不同拷贝质粒对WML001积累L-赖氨酸的影响 | 第101页 |
| 2.4 本章小结 | 第101-103页 |
| 第三章 核糖开关筛选平台的构建 | 第103-117页 |
| 3.1 实验材料与方法 | 第104-107页 |
| 3.1.1 实验所用菌株和质粒 | 第104-105页 |
| 3.1.2 本章实验所采用的引物序列 | 第105-106页 |
| 3.1.3 质粒pUC19-gfp、pCL1920-gfp以及pUC19-tetA、pCL1920-tetA的构建 | 第106-107页 |
| 3.1.4 核糖开关系统验证菌株的构建 | 第107页 |
| 3.1.5 重组菌株的培养 | 第107页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第107-115页 |
| 3.2.1 核糖开关系统的功能验证 | 第107-111页 |
| 3.2.2 核糖开关在生理情况下的功能验证 | 第111-115页 |
| 3.3 本章小结 | 第115-117页 |
| 第四章 利用核糖开关富集天冬氨酸激酶BT的有益突变 | 第117-150页 |
| 4.1 实验材料与方法 | 第120-126页 |
| 4.1.1 本章实验所使用的菌株和质粒 | 第120-121页 |
| 4.1.2 本章实验所采用的引物序列 | 第121-123页 |
| 4.1.3 质粒pET28a-lysC~(fbr)、pET28a-bt以及重组大肠杆菌BL21的构建 | 第123页 |
| 4.1.4 常用试剂的配制 | 第123-125页 |
| 4.1.4.1 SDS-PAGE蛋白质电泳相关溶液的配制 | 第123-125页 |
| 4.1.4.2 蛋白镍柱纯化Buffer的配制 | 第125页 |
| 4.1.5 BT蛋白的表达 | 第125页 |
| 4.1.6 BT蛋白的纯化 | 第125-126页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第126-148页 |
| 4.2.1 构建质粒pUC19-dapA~(fbr)及MG1655基因组上dapA基因的定点突变 | 第126-127页 |
| 4.2.2 核糖开关元件促进bt随机突变库的定向进化 | 第127-131页 |
| 4.2.2.1 基因bt随机突变库的建立 | 第127-128页 |
| 4.2.2.2 基因bt随机突变库的筛选 | 第128-131页 |
| 4.2.3 利用所筛选得到的bt突变体进行L-赖氨酸的摇瓶发酵检测 | 第131-137页 |
| 4.2.4 BT酶活检测及结构建模 | 第137-148页 |
| 4.2.4.1 BT酶活测定 | 第137-141页 |
| 4.2.4.2 BT蛋白结构建模以及酶活分析 | 第141-148页 |
| 4.3 本章小结 | 第148-150页 |
| 全文总结 | 第150-153页 |
| 参考文献 | 第153-167页 |
| 致谢 | 第167-168页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第168-179页 |
| 附件 | 第179页 |
