| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 专业词汇中英文对照表 | 第11-18页 |
| 1 引文 | 第18-40页 |
| 1.1 RNA的修饰 | 第18-20页 |
| 1.2 m~6A(N~6-甲基腺嘌呤) | 第20-22页 |
| 1.3 m~6A的研究方法 | 第22-28页 |
| 1.3.1 通过突变m~6A位点研究m~6A功能 | 第22-23页 |
| 1.3.2 通过m~6A抑制剂进行研究 | 第23页 |
| 1.3.3 m~6A抗体富集结合第二代高通量测序(MeRIP-Seq) | 第23-24页 |
| 1.3.4 通过m6A结合蛋白研究m6A的生物学功能 | 第24-25页 |
| 1.3.5 m~6A的单位点检测方法 | 第25-28页 |
| 1.4 m~6A去甲基化酶---FTO和ALKBH5 | 第28-31页 |
| 1.5 m~6A甲基转移酶 | 第31-34页 |
| 1.6 m~6A结合蛋白 | 第34-35页 |
| 1.7 m~6A与miRNA | 第35-36页 |
| 1.8 m~6A的功能 | 第36-38页 |
| 1.9 m~6A与人类疾病 | 第38-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-76页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-49页 |
| 2.1.1 主要实验试剂 | 第40-42页 |
| 2.1.2 分子克隆主要使用的酶 | 第42页 |
| 2.1.3 主要试剂盒 | 第42-44页 |
| 2.1.4 主要抗体 | 第44-45页 |
| 2.1.5 干扰siRNA | 第45-46页 |
| 2.1.6 引物 | 第46-47页 |
| 2.1.7 主要仪器及耗材 | 第47-48页 |
| 2.1.8 细胞系 | 第48-49页 |
| 2.2 重要实验试剂配制 | 第49-54页 |
| 2.2.1 大肠杆菌培养相关试剂 | 第49页 |
| 2.2.2 细胞培养相关试剂 | 第49-50页 |
| 2.2.3 蛋白免疫印迹相关溶液 | 第50-52页 |
| 2.2.4 其他重要溶液的配制 | 第52-54页 |
| 2.3 实验方法 | 第54-76页 |
| 2.3.1 细胞培养及传代 | 第54页 |
| 2.3.2 重组质粒的构建 | 第54-58页 |
| 2.3.2.1 细胞内总RNA提取 | 第54页 |
| 2.3.2.2 RNA的反转录(RT-PCR) | 第54-55页 |
| 2.3.2.3 目的基因的扩增 | 第55页 |
| 2.3.2.4 PCR产物的纯化 | 第55-56页 |
| 2.3.2.5 目的基因和载体的双酶切 | 第56页 |
| 2.3.2.6 载体5’端去磷酸化 | 第56-57页 |
| 2.3.2.7 目的基因和载体的连接 | 第57页 |
| 2.3.2.8 重组质粒的转化和涂板 | 第57页 |
| 2.3.2.9 挑单克隆 | 第57页 |
| 2.3.2.10 重组质粒的提取(SDS碱裂解法粗提质粒) | 第57-58页 |
| 2.3.2.11 重组质粒的鉴定(跑胶鉴定和测序鉴定) | 第58页 |
| 2.3.3 重组质粒的转染及表达验证 | 第58-60页 |
| 2.3.3.1 重组质粒的转染(PEI转染) | 第58-59页 |
| 2.3.3.2 重组质粒表达效果的鉴定 | 第59-60页 |
| 2.3.3.2.1 细胞内总蛋白的提取 | 第59页 |
| 2.3.3.2.2 蛋白浓度的测定 | 第59-60页 |
| 2.3.3.2.3 聚丙烯凝胶电泳和蛋白免疫印迹 | 第60页 |
| 2.3.4 mRNA上m~6A含量检测 | 第60-61页 |
| 2.3.4.1 mRNA的提取 | 第60页 |
| 2.3.4.2 斑点杂交(Dot blot) | 第60-61页 |
| 2.3.5 基因敲低方法和基因敲低效果的检测 | 第61-62页 |
| 2.3.5.1 脂质体介导的siRNA的转染 | 第61页 |
| 2.3.5.2 基因敲低效果的检测 | 第61-62页 |
| 2.3.5.2.1 蛋白免疫印迹检测 | 第61-62页 |
| 2.3.6 免疫荧光 | 第62-63页 |
| 2.3.6.1 细胞内源表达蛋白的细胞定位研究 | 第62页 |
| 2.3.6.2 细胞外源表达蛋白的细胞定位研究 | 第62页 |
| 2.3.6.3 RNase A处理的情况下蛋白定位的研究 | 第62-63页 |
| 2.3.7 细胞凋亡检测 | 第63页 |
| 2.3.8 串联亲和沉淀和质谱分析 | 第63-65页 |
| 2.3.8.1 免疫沉淀(immunoprecipitation) | 第63-64页 |
| 2.3.8.2 质谱分析 | 第64-65页 |
| 2.3.9 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation) | 第65-66页 |
| 2.3.9.1 外源表达蛋白的免疫共沉淀 | 第65页 |
| 2.3.9.2 内源表达蛋白的免疫共沉淀 | 第65-66页 |
| 2.3.10 GST标签蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| 2.3.10.1 蛋白表达的可溶性鉴定 | 第66页 |
| 2.3.10.2 GST标签蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| 2.3.11 His标签蛋白的纯化 | 第67-68页 |
| 2.3.12 GST pulldown | 第68页 |
| 2.3.13 斑马鱼基因敲低模型 | 第68-69页 |
| 2.3.14 PAR-CLIP(Photo-Activatable Ribonucleoside enhanced crosslinkingand immune-precipitation)光活性增强的核糖核苷酸交联和免疫沉淀 | 第69-73页 |
| 2.3.14.1 样品的准备 | 第72-73页 |
| 2.3.14.2 测序结果的分析 | 第73页 |
| 2.3.15 转录组样品分析 | 第73-74页 |
| 2.3.16 可变剪接分析 | 第74-76页 |
| 3 结果 | 第76-98页 |
| 3.1 METTL3互作蛋白的筛选和鉴定 | 第76-85页 |
| 3.1.1 SFB-METTL3重组质粒的构建和表达鉴定 | 第76-78页 |
| 3.1.2 串联亲和沉淀筛选METTL3互作蛋白 | 第78-79页 |
| 3.1.3 METTL3互作蛋白的鉴定 | 第79-85页 |
| 3.1.3.1 WTAP及METTL14与METTL3在体内形成蛋白复合物 | 第79-81页 |
| 3.1.3.2 WTAP和METTL3的相互作用是直接的 | 第81-82页 |
| 3.1.3.3 WTAP的N端在与METTL3相互作用中起到重要的作用 | 第82-83页 |
| 3.1.3.4 METTL3和WTAP之间的相互作用不受m6A和RNA影响 | 第83-84页 |
| 3.1.3.5 METTL3、WTAP及METTL14之间的相互作用不受彼此影响 | 第84-85页 |
| 3.2 WTAP可以影响细胞内mRNA上m6A水平 | 第85-87页 |
| 3.3 WTAP、METTL3及METTL14的细胞定位研究 | 第87-90页 |
| 3.3.1 WTAP、METTL3及METTL14都定位在speckle中且其定位受RNaseA的影响 | 第87-88页 |
| 3.3.2 WTAP招募METTL3和METTL14到核小斑中 | 第88-90页 |
| 3.3.2.3 PAR-CLIP进一步证明WTAP招募METTL3到核小斑中 | 第89-90页 |
| 3.4 METTL3和WTAP的主要作用底物是mRNA,且其结合序列主要存在于3 ‘UTR并与m~6A序列一致 | 第90-93页 |
| 3.5 METTL3和WTAP影响基因的表达和选择性剪接 | 第93-95页 |
| 3.6 WMM复合物在斑马鱼组织分化中起到重要的作用 | 第95-98页 |
| 4 讨论 | 第98-100页 |
| 参考文献 | 第100-107页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第107-108页 |
