| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-7页 |
| 符号说明 | 第7-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-28页 |
| 1 星状病毒的研究进展 | 第12-13页 |
| 2 病原学 | 第13-17页 |
| ·分类 | 第13页 |
| ·形态学 | 第13-14页 |
| ·生物学特性 | 第14-15页 |
| ·分子病原学 | 第15-16页 |
| ·致病性 | 第16-17页 |
| 3 流行病学 | 第17-19页 |
| ·流行概况 | 第17-19页 |
| ·传播途径 | 第19页 |
| 4 临床症状与病理变化 | 第19-21页 |
| ·临床症状 | 第19-20页 |
| ·病理变化 | 第20-21页 |
| 5 检测方法 | 第21-26页 |
| ·电镜直接观察法 | 第21页 |
| ·细胞培养和组织分离 | 第21页 |
| ·免疫学检测技术 | 第21-22页 |
| ·免疫荧光技术(immunofluorescence) | 第21-22页 |
| ·酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay; ELISA） | 第22页 |
| ·分子生物学检测 | 第22-26页 |
| ·逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） | 第22-23页 |
| ·实时荧光定量RT-PCR法 | 第23-24页 |
| ·环介导等温扩增技术 | 第24-25页 |
| ·基因芯片 | 第25-26页 |
| ·核酸序列依赖扩增技术 ( nucleic acidsequence based amplification ， NASBA) | 第26页 |
| 6 治疗与预防 | 第26页 |
| 7 研究展望 | 第26-27页 |
| 8 本研究的目的和意义 | 第27-28页 |
| 第二章 犬星状病毒半巢式RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第28-42页 |
| 1 材料 | 第28-29页 |
| ·粪便样本 | 第28页 |
| ·病毒样品 | 第28-29页 |
| ·主要试剂 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29页 |
| 2 实验方法 | 第29-31页 |
| ·引物的设计与合成 | 第29-30页 |
| ·病毒总RNA的提取 | 第30页 |
| ·cDNA的合成 | 第30-31页 |
| 3 半巢式RT-PCR方法的建立 | 第31-33页 |
| ·半巢式RT-PCR条件的优化 | 第31-32页 |
| ·最适模板浓度的确定 | 第31页 |
| ·最适引物使用量的确定 | 第31页 |
| ·最适Taq酶浓度的确定 | 第31页 |
| ·最适退火温度的确定 | 第31页 |
| ·最适Mg2+浓度的确定 | 第31-32页 |
| ·最适dNTP浓度的确定 | 第32页 |
| ·PCR扩增体系与循环参数 | 第32页 |
| ·扩增产物的检测与分析 | 第32页 |
| ·PCR特异性试验 | 第32-33页 |
| ·PCR敏感性试验 | 第33页 |
| ·PCR重复性实试验 | 第33页 |
| ·半巢式RT-PCR检测方法的应用 | 第33页 |
| 4 结果 | 第33-40页 |
| ·最佳的PCR反应条件 | 第33-36页 |
| ·扩增产物的检测与序列分析 | 第36-38页 |
| ·PCR方法特异性试验 | 第38页 |
| ·PCR方法敏感性试验 | 第38-39页 |
| ·重复性试验 | 第39页 |
| ·临床样品的检测 | 第39-40页 |
| 5 讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 犬星状病毒ORF1B和ORF2扩增及序列分析 | 第42-59页 |
| 1 技术原理 | 第42-44页 |
| 2 引物设计 | 第44-45页 |
| 3 反应条件 | 第45-48页 |
| ·cDNA的合成 | 第45页 |
| ·长片段扩增反应条件 | 第45-46页 |
| ·染色体步移技术 | 第46-48页 |
| ·1st PCR 反应 | 第46-47页 |
| ·2nd PCR反应 | 第47页 |
| ·3rd PCR反应 | 第47-48页 |
| 4 结果 | 第48-54页 |
| ·测序结果的拼接 | 第48-52页 |
| ·犬星状病毒ORF2序列信息 | 第48-49页 |
| ·犬星状病毒ORF1b序列信息 | 第49-51页 |
| ·犬星状病毒部分ORF1a序列信息 | 第51-52页 |
| ·系统进化树分析 | 第52-54页 |
| 5 ORF2编码氨基酸差异分析 | 第54-55页 |
| 6 ORF2衣壳蛋白二级结构及B细胞表位预测 | 第55-57页 |
| 7 讨论 | 第57-59页 |
| 第四章 犬星状病毒P1蛋白的原核表达及纯化 | 第59-76页 |
| 1 材料 | 第59-60页 |
| ·病毒、菌株和质粒 | 第59页 |
| ·主要试剂 | 第59-60页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| 2 实验方法 | 第60-68页 |
| ·目的基因的扩增、纯化和回收 | 第60-63页 |
| ·引物的设计与合成 | 第60-61页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第61-62页 |
| ·cDNA的合成 | 第61页 |
| ·PCR扩增 | 第61-62页 |
| ·目的片段的纯化回收 | 第62-63页 |
| ·目的基因的克隆 | 第63-65页 |
| ·克隆质粒的构建 | 第63页 |
| ·克隆质粒的筛选及制备 | 第63-65页 |
| ·克隆质粒的转化与筛选 | 第63页 |
| ·重组质粒的提取及鉴定 | 第63-65页 |
| ·P1基因原核表达载体（pET-30a-P1）的构建 | 第65-66页 |
| ·带粘性末端P1核苷酸片段的制备 | 第65页 |
| ·带粘性末端表达载体的制备 | 第65页 |
| ·目的基因与线性化表达载体pET-30a的连接 | 第65页 |
| ·连接产物的转化和阳性重组子的筛选鉴定 | 第65-66页 |
| ·重组表达载体诱导表达的鉴定 | 第66页 |
| ·重组质粒pET-30a-P1诱导原核表达条件优化 | 第66-67页 |
| ·不同诱导时间对重组质粒pET-30a-P1表达的影响 | 第66-67页 |
| ·不同诱导温度对重组质粒pET-30a-P1表达的影响 | 第67页 |
| ·重组质粒pET-30a-P1原核表达产物可溶性分析 | 第67页 |
| ·表达产物的纯化 | 第67-68页 |
| ·包涵体的分离和变性 | 第67页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第67-68页 |
| ·表达产物的复性 | 第68页 |
| 3 结果 | 第68-74页 |
| ·P1基因的PCR结果 | 第68-69页 |
| ·目的片段的克隆鉴定 | 第69页 |
| ·原核重组表达载体的鉴定 | 第69页 |
| ·P1蛋白原核表达的鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组质粒pET-30a-P1阳性BL21(DE3)菌诱导表达条件的优化 | 第70-72页 |
| ·重组载体诱导表达时间的优化 | 第70-71页 |
| ·重组载体诱导表达温度的优化 | 第71-72页 |
| ·蛋白的可溶性分析 | 第72-73页 |
| ·蛋白的纯化 | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74-76页 |
| 第五章 结论 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-84页 |
| 附录Ⅰ 试剂配置 | 第84-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第87-89页 |
