| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-27页 |
| 1.1 大肠杆菌可溶表达策略 | 第13-21页 |
| 1.1.1 融合表达 | 第13-17页 |
| 1.1.2 分子伴侣共表达 | 第17-19页 |
| 1.1.3 表达宿主的选择 | 第19-20页 |
| 1.1.4 培养条件的优化 | 第20-21页 |
| 1.2 EGF的介绍 | 第21-23页 |
| 1.2.1 EGF蛋白结构及功能 | 第21-22页 |
| 1.2.2 EGF表达的研究情况 | 第22-23页 |
| 1.2.3 EGF的临床应用 | 第23页 |
| 1.3 内含肽系统 | 第23-25页 |
| 1.3.1 p H诱导切除的内含肽 | 第24页 |
| 1.3.2 硫醇诱导切除的内含肽 | 第24-25页 |
| 1.4 本论文的研究内容及意义 | 第25-27页 |
| 1.4.1 技术路线 | 第25页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第25-26页 |
| 1.4.3 研究意义 | 第26-27页 |
| 第二章 SUMO-EGF与分子伴侣共表达 | 第27-54页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-33页 |
| 2.2.1 菌种、引物及载体 | 第27-29页 |
| 2.2.2 主要仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第30页 |
| 2.2.4 常用培养基及溶液的配制 | 第30-33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-45页 |
| 2.3.1 SUMO-EGF与分子伴侣共表达 | 第33-38页 |
| 2.3.2 ULP1P的载体构建、表达及纯化 | 第38-43页 |
| 2.3.3 ULP1P蛋白酶表达及活性验证 | 第43页 |
| 2.3.4 去SUMO化后二次纯化 | 第43-44页 |
| 2.3.5 hEGF的活性鉴定 | 第44-45页 |
| 2.4 实验结果 | 第45-53页 |
| 2.4.1 SUMO-EGF与不同分子伴侣共表达情况 | 第45-46页 |
| 2.4.2 培养条件优化 | 第46-48页 |
| 2.4.3 大量表达及纯化结果 | 第48-49页 |
| 2.4.4 pET21c-Ulp1p载体构建结果 | 第49-50页 |
| 2.4.5 ULP1P表达及纯化结果 | 第50页 |
| 2.4.6 ULP1P酶切条件优化 | 第50-52页 |
| 2.4.7 酶切产物的纯化 | 第52页 |
| 2.4.8 hEGF生物活性鉴定 | 第52-53页 |
| 2.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第三章p H诱导的C端自切内含肽应用于EGF表达 | 第54-65页 |
| 3.1 引言 | 第54页 |
| 3.2 实验材料 | 第54-55页 |
| 3.2.1 菌株、引物及载体 | 第54页 |
| 3.2.2 主要仪器设备 | 第54-55页 |
| 3.2.3 主要溶液试剂 | 第55页 |
| 3.3 实验方法 | 第55-59页 |
| 3.3.1 Restriction free (RF)克隆构建His-Ssp Dna B-EGF(HSSE)载体 | 第55-56页 |
| 3.3.2 HSSE小量表达 | 第56-57页 |
| 3.3.3 HSSE大量表达及纯化 | 第57页 |
| 3.3.4 RF克隆构建SUMO-Ssp Dna B-EGF-His(SSEH)载体 | 第57-58页 |
| 3.3.5 SSEH小量表达 | 第58-59页 |
| 3.3.6 SSEH大量表达、纯化及Western blot检测 | 第59页 |
| 3.4 实验结果 | 第59-64页 |
| 3.4.1 HSSE载体构建 | 第59页 |
| 3.4.2 HSSE小量表达结果 | 第59-60页 |
| 3.4.3 HSSE大量表达及纯化 | 第60-61页 |
| 3.4.4 SSEH载体构建 | 第61-62页 |
| 3.4.5 SSEH小量表达结果 | 第62页 |
| 3.4.6 SSEH大量表达、纯化及Western blot检测 | 第62-64页 |
| 3.5 本章小结 | 第64-65页 |
| 第四章 硫醇诱导的N端自切内含肽应用于EGF表达 | 第65-79页 |
| 4.1 引言 | 第65页 |
| 4.2 实验材料 | 第65-66页 |
| 4.2.1 菌株、引物及载体 | 第65页 |
| 4.2.2 主要仪器设备 | 第65页 |
| 4.2.3 主要溶液试剂 | 第65-66页 |
| 4.3 实验方法 | 第66-72页 |
| 4.3.1 pET21c-EGF表达载体构建 | 第66-68页 |
| 4.3.2 RF克隆构建EGF-SUMO表达载体 | 第68-69页 |
| 4.3.3 EGF-SUMO小量表达 | 第69-70页 |
| 4.3.4 RF克隆构建EGF-Mxe Gyr A-SUMO-His（EMSH）载体 | 第70-71页 |
| 4.3.5 EMSH小量表达 | 第71页 |
| 4.3.6 EMSH大量表达、纯化及Western blot | 第71页 |
| 4.3.7 DTT诱导内含肽自切及二次纯化 | 第71-72页 |
| 4.3.8 hEGF生物活性鉴定 | 第72页 |
| 4.4 实验结果 | 第72-77页 |
| 4.4.1 pET21c-EGF载体构建 | 第72页 |
| 4.4.2 EGF-SUMO载体构建 | 第72-73页 |
| 4.4.3 EGF-SUMO小量表达 | 第73-74页 |
| 4.4.4 EMSH载体构建 | 第74页 |
| 4.4.5 EMSH小量表达 | 第74-75页 |
| 4.4.6 EMSH大量表达、纯化、Western blot | 第75-76页 |
| 4.4.7 DTT诱导内含肽自切及二次纯化 | 第76-77页 |
| 4.4.8 重组hEGF活性鉴定 | 第77页 |
| 4.5 本章小结 | 第77-79页 |
| 结论与展望 | 第79-81页 |
| 1 结论 | 第79页 |
| 2 创新点 | 第79-80页 |
| 3 展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-89页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 附件 | 第91页 |
