| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 缩略表 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-17页 |
| 1. 革兰氏阴性菌 | 第11页 |
| 2. 铁是病原菌毒力的关键调控因子 | 第11-13页 |
| 3. 外膜蛋白 OmpW 为毒力相关蛋白 | 第13-15页 |
| 4. 研究目的和意义 | 第15-16页 |
| 5. 技术路线和方法 | 第16-17页 |
| 第二章 ompW 基因补救菌的构建 | 第17-35页 |
| 1. 前言 | 第17-18页 |
| 2. 实验材料、试剂和仪器 | 第18-21页 |
| ·材料 | 第18页 |
| ·试剂 | 第18-19页 |
| ·仪器 | 第19页 |
| ·主要试剂的配置 | 第19-21页 |
| 3. 方法 | 第21-30页 |
| ·大肠杆菌 K12 基因组的提取 | 第21页 |
| ·ompW 基因的引物设计 | 第21-22页 |
| ·ompW 基因的扩增 | 第22页 |
| ·pACYC184 质粒的提取 | 第22-23页 |
| ·ompW 基因的单酶切 | 第23页 |
| ·pACYC184 质粒的单酶切及去磷酸化 | 第23-24页 |
| ·pACYC184 与 ompW 基因酶切片段连接 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备 | 第25页 |
| ·连接产物转化 DH5α感受态细胞 | 第25页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的鉴定 | 第25-27页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的单酶切鉴定 | 第25-26页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的 PCR 鉴定 | 第26-27页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的测序鉴定 | 第27页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 转化 ompW 基因敲除菌 | 第27页 |
| ·ompW 基因敲除菌感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 转化ΔompW 的 PCR 鉴定 | 第27页 |
| ·提取大肠杆菌 K12、ΔompW、ΔompW+pACYC184-ompW 膜蛋白 | 第27-28页 |
| ·Western blot 验证ΔompW+pACYC184-ompW | 第28页 |
| ·质谱鉴定 OmpW | 第28-30页 |
| ·胶内酶解 | 第28-29页 |
| ·质谱鉴定 | 第29-30页 |
| 4. 结果 | 第30-34页 |
| ·PCR 扩增 ompW 基因 | 第30页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的鉴定 | 第30-32页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的单酶切鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的 PCR 鉴定 | 第31-32页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 的测序鉴定 | 第32页 |
| ·重组质粒 pACYC184-ompW 转化ΔompW 的 PCR 鉴定 | 第32页 |
| ·Western blot 验证ΔompW+pACYC184-ompW | 第32-33页 |
| ·MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定 OmpW 蛋白 | 第33-34页 |
| 5. 讨论 | 第34-35页 |
| 第三章 OmpW 与铁平衡间的关系 | 第35-45页 |
| 1. 前言 | 第35页 |
| 2. 实验材料 | 第35-38页 |
| ·试剂 | 第35-36页 |
| ·仪器 | 第36页 |
| ·主要试剂的配置 | 第36-38页 |
| 3. 方法 | 第38-40页 |
| ·确定 OmpW 表达受铁离子调控 | 第38-39页 |
| ·Western blot 检测 OmpW 在 M9 培养基中铁离子浓度增加的表达情况 | 第38-39页 |
| ·Western blot 检测 OmpW 在 LB 培养基中铁离子浓度降低的表达情况 | 第39页 |
| ·确定 OmpW 对铁离子的转运作用 | 第39-40页 |
| ·检测细菌对铁离子的摄取 | 第39-40页 |
| 4. 结果 | 第40-43页 |
| ·OmpW 表达受铁离子的调控 | 第40-42页 |
| ·M9 培养基中 OmpW 随铁离子浓度增加而上调 | 第40-41页 |
| ·LB 培养基中 OmpW 随铁离子浓度降低而下调 | 第41-42页 |
| ·OmpW 可能与对铁离子的摄取有关 | 第42-43页 |
| 5. 讨论 | 第43-45页 |
| 第四章 铁对 OmpW 调控的转录因子 | 第45-61页 |
| 1. 前言 | 第45页 |
| 2. 材料 | 第45-48页 |
| ·菌株和质粒 | 第45页 |
| ·实验试剂 | 第45-46页 |
| ·仪器 | 第46-47页 |
| ·主要试剂的配置 | 第47-48页 |
| 3. 方法 | 第48-54页 |
| ·Real-Time PCR 检测 K12 菌在正常和限铁条件下 Fur 和 SoxS 的表达情况 | 第48-50页 |
| ·Real-Time PCR 引物的设计 | 第48页 |
| ·细菌总 RNA 的提取 | 第48-49页 |
| ·总 RNA 的反转录 | 第49页 |
| ·Real-Time PCR | 第49-50页 |
| ·检测 Fur、SoxS 高表达菌中 OmpW 的表达情况 | 第50-54页 |
| ·Fur、SoxS 高表达菌的构建 | 第50-53页 |
| ·Real-Time PCR 检测 Fur、SoxS 高表达菌分别在正常和铁限制培养条件下的OmpW 的表达情况 | 第53页 |
| ·Westernblot 检测 Fur、SoxS 高表达菌分别在正常和铁限制条件下的 OmpW 的表达情况 | 第53-54页 |
| 4. 结果 | 第54-59页 |
| ·转录因子 Fur 可能参与铁对 OmpW 调控 | 第54页 |
| ·Fur、SoxS 高表达菌的构建 | 第54-56页 |
| ·PCR 扩增 fur 、soxS 基因 | 第54-55页 |
| ·重组质粒 pET-28a(+)-fur、pET-28a(+)-soxS 的鉴定 | 第55-56页 |
| ·Fur、SoxS 蛋白的诱导表达 | 第56页 |
| ·OmpW 在 Fur 高表达菌中表达上调、SoxS 高表达菌中表达下调 | 第56-59页 |
| 5. 讨论 | 第59-61页 |
| 第五章 OmpW 在氧化应激中的作用 | 第61-66页 |
| 1. 前言 | 第61页 |
| 2. 材料 | 第61-62页 |
| ·实验试剂 | 第61页 |
| ·仪器 | 第61-62页 |
| ·主要试剂的配置 | 第62页 |
| 3. 方法 | 第62-63页 |
| ·检测 K12、ΔompW 和+ompW 在不同浓度 H2O2应激处理下的存活情况 | 第62-63页 |
| ·检测 K12 在不同浓度 H2O2处理下 OmpW 的表达情况 | 第63页 |
| 4. 结果 | 第63-65页 |
| ·K12、ΔompW 和+ompW 在不同浓度 H2O2应激处理下的存活情况 | 第63-65页 |
| ·K12 的 OmpW 表达量在 H2O2处理后下调 | 第65页 |
| 5. 讨论 | 第65-66页 |
| 第六章 结论与展望 | 第66-67页 |
| 1. 结论 | 第66页 |
| 2. 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-74页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
